【原理】
引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成2—3个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。
本实验用内切酶将T-GFP质粒的GFP cDNA切割下来，与用同样内切酶消化的pcDNA3.1连接，构建真核表达载体pcDNA3.1-GFP。
【试剂】
1.菌种含绿色荧光蛋白重组子T-GFP质粒
2.LB液体培养基称取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl3.0g，加双蒸水200ml溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。
3.10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液在无菌条件下配制，－20℃贮存备用。
4.含Amp的LB固体培养基每100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50℃(用手背碰一下瓶壁不致烫手)，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。
5.Tris-HCl饱和酚(pH8.0)。
6.溶液Ⅰ含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，临用前加溶菌酶至2mg/ml。
7.溶液Ⅱ含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。
8.溶液Ⅲ5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。
9.10mg/mlRNaseA称取RNaseA10mg溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。
10.TE缓冲液(pH8.0)含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)，以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4℃贮存。
11.限制性内切酶EcoRⅠ及其缓冲液只需购买国内试剂公司的产品即可，每种RE均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该RE均可获得100%酶切活性。
12.50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml。1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。
13.溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液)称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH1滴，调至蓝色。
14.溴化乙锭(EB，1mg/ml)戴手套谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50μlEB。
15.DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5μg/μl。
16.其他试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇。
【操作步骤】
1.将下列试剂缓冲液2μl，T-GFP质粒或pcDNA3.1质粒(1μg)，KpnI和ApaI各5～10U加至0.5mlEP管中，加双蒸水至20μl，加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。
2.琼脂糖凝胶电泳在进行酶切时预先灌好.称取1g琼脂糖，加2ml50×TAE电泳Buffer和98ml蒸馏水，在电炉或微波炉上溶解，配制成1%琼脂糖凝胶100ml，稍冷后，加5μl10mg/mlEB，混匀.安装好电泳槽和样品梳，灌胶。
3.上样在电泳槽内盛放1×TAE，撕去制胶托架两端的封胶，将制胶托架装入电泳槽内，小心取出样品梳.取PCR样品10μl，加2μl6×载样buffer在Parafilm膜上混匀，上样。
4.电泳正确连接电极，在100V恒压条件进行电泳，待蓝色染料泳过2/3段凝胶，停止电泳。
5.取出凝胶，在紫外分析仪上观察结果，分析判断酶切产物的大小。
6.将730bp的GFPcDNA和5.4kb的线性pcDNA3.1切胶回收（参见实验三步骤9）。
用连接酶将GFPcDNA片段与线性的pcDNA3.1载体连接。
在0.2ml或0.5ml反应管中加入下列成分
pcDNA3.150ng
GFPcDNA100ng
T4连接酶2-3weissunits
10×连接缓冲液1μl
补超纯水至总体积为10μl，常温下放置30分钟以上；也可以16℃或4℃过夜。
7.重组子的转化
在无菌条件下按每管取100μl新鲜感受态细菌置于无菌的1.5ml塑料离心管中，共2管，分别加入连接产物和消毒水(作阴性对照)各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。42℃，热休克90s，中途不要摇动离心管，每管加800μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气摇床中以150r/min速度振摇45min，使细菌复苏。每管取200μl加至含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置20min，使液体吸收，然后37℃倒置培养12～16h至单菌落形成。
8.提取质粒,酶切鉴定的阳性重组子,命名为pcDNA3.1-GFP?
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