3．制备电泳凝胶及电泳
(1)制备胶模：取双块制胶玻板，先用泡沫海绵沾“洗洁净”液仔细擦洗，用水彻底淋洗，干燥后继用酒精清洗，晾干，再用硅烷剂(repel- silane)将玻板的—面擦一遍，蒸馏水淋洗，干燥 (注意：清洗时应戴一次性手套操作)。
将其中一块玻板平置台上(硅烷处理过的—面朝上)，两侧各放置一条隔离条(最好选用上方厚为0.2mm，下方厚0.4mm的楔形条)，另取—块玻板 (硅烷化处理过的—面朝下)，对准放置在上述玻板上，两侧及—面边缘用胶带封严，并用文具夹夹紧，制成胶模。
(2)配制电泳凝胶：向1只100ml烧杯中加入下列试剂；20%丙烯酰胺溶液20ml；10×TBE缓冲液5ml；46.7%尿素溶液25ml。总体积50ml(凝胶的丙烯酰胺浓度为8%)。混匀，过滤除去不溶物，置100ml梨形瓶中连接水泵抽气5分钟，加入250μl
10%过硫酸铵，50μlTEMED混匀。
(3)注胶：立即将配好的凝胶用50ml注射器小心注入制好的玻板胶模中(胶模宜倾斜45度左右)，注意防止气泡，如有气泡产生，可敲击该部位玻璃，使气泡上升排除。从上面插入梳齿背，深入胶面约10-12mm。将胶模水平放置45-60分钟，待凝胶聚合。
(4)电泳：凝胶聚合后，拨掉梳齿，撕去玻板下缘胶带，用蒸馏水淋洗凝胶表面，以除去未聚合物质。将胶板装置在电泳槽上，上下槽加入缓冲液，注意排除凝胶下缘气泡。接通电源，40W预电泳45-60分钟。预电泳结束后，断电。插入样品梳，梳齿向下插入凝胶中3mm左右。用缓冲液小心冲洗每一加样小槽
(齿间空隔)，用记号笔标明A、G、C和T4个小槽，每槽加入变性后的链延伸/终止液1.5-2μl。接通电源，40W恒压，电泳至示踪染料溴酚蓝至底边时切断电源。如待测片段较长而需继续点样，则等示踪染料二甲苯腈蓝称至距下缘4-5cm时切断电源，用缓冲液冲洗另一组4个加样小槽(应与前一组相隔
1-2个加样小槽)，重复上样操作，然后继续电泳至第2组示踪染料溴酚蓝移至玻板下缘时断电，停止电泳。
4．放射自显影及结果分析
将凝胶板自电泳槽取下后水平放置，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。可将凝胶切下一小角以示方向。
在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。
于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，置70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。然后由下而上读序。
[注意事项]
1．操作顺序参考表
(1)制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。
(2)检查实验计划及试剂。
(3)预电泳。
(4)预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。
(5)点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。
(6)固定、干燥凝胶。
(7)放射自显影。
2．M13重组子的培养
(1)挑取单一的大肠杆菌集落加入3ml LB培养基中，37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。
(2)取200μl上述大肠杆菌培养物，加入含有2ml 2×YT培养基的试管中，再将插入待测DNA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中，在37℃剧烈振荡培养至少5小时，但不宜超过8小时。
(3)通过两轮离心将细胞除去，第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。存放4℃待用。
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