一、实验目的
用T4DNA连接酶将载体pBR322 EcoR Ⅰ-CIP处理的DNA片段，与目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。
二、实验原理
重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。
（一）DNA连接酶的作用步骤
1．T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物（腺苷酰酶）
2．酶－AMP复合物再结合到具有5´-磷酸基和3´-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
3．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
（二）DNA的连接方式
在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。
连接的方式有：
1．自连
2．两种片段相连
3．三个片段以上的自连与互连
（三）连接反应的条件
1．缓冲液：一般商品酶都带有10倍的缓冲液，有Mg2＋、ATP作为辅助因子，提供能量，同时也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清蛋白）维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。
2．温度：连接反应温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，EcoR
Ⅰ酶所产生的末端，仅仅通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的分子热运动。因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，为12～16℃。
3．时间：12～16℃ 12～16小时（过夜）；或7～8℃ 2～3天。
三．实验材料
1．pBR322 EcoR Ⅰ-CIP处理DNA片段。
2．5.4Kb含有Str的EcoR Ⅰ回收DNA片段。
3．T4DNA连接酶
四．实验仪器、器皿及试剂
仪器、器皿（见附录）
试剂：10×T4DNA连接酶缓冲液
660mmol/L Tris-HCl(pH7.5)
50 mmol/L MgCl2
50 mmol/L DDT
50 mmol/L ATP
五．实验步骤
1．取3只Eppendorf管，一管做重组连接，一管做pBR322未经CIP处理的自连，另一管做pBR322经CIP处理的自连。
2．用微量进样器按下表分别取样各溶液于Eppendorf管中。。
| DNA酶切反应物 | 10×T4连接缓冲液 | ddH2O | T4DNA连接酶 | 总体积 |
|
pBR322 EcoRⅠ-CIP 5μl（100ng） 5.4Kb EcoR Ⅰ片段 5μl（约400ng） |
2μl | 7μl | 1μl | 20μl |
|
pBR322 EcoRⅠ-CIP 3μl（60ng） |
2μl | 14μl | 1μl | 20μl |
|
pBR322 EcoRⅠ 3μl（60ng） |
2μl | 14μl | 1μl | 20μl |
加样顺序为ddH2O，10×T4缓冲液，DNA片段，最后加T4DNA连接酶（放于冰浴中）连接酶取好后应立即放回－20℃保存。
3．盖紧盖子用手指弹匀Eppendorf管，于台式离心机上转2秒钟，以集中样品。
4．将3管连接样品放入温度12℃恒温水浴锅中，过夜。
5．第二天上午各管取约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时要加入pBR322 EcoR Ⅰ酶切片段作电泳对照。
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