3,染色,将胶板移至染色液中,摇床震荡30分钟。
4,凝胶洗涤,将染色后的胶板,放入超纯水中2-3秒后,迅速取出并竖起控水,随后把胶板放入预冷的显影液中(用量为总量的1/2),充分震荡,当第一批条带后,把胶板移入预冷的另一半显影液中,震荡,直至全部条带出现。
注意:从放入水到放入显影液中,之间时间不超过5-10秒。
5,终止显影,在显影液中直接加入等体积的固定/终止溶液(第一步操作时用过的),停止显影反应并固定影象。
6,洗涤凝胶,在超纯水中洗涤凝胶2次,每次2分钟。
7,胶板干燥,将显影后的胶板置于室温下,自然干燥。
8,干燥后的胶片可以永久保存,或进行拍照或进行EDF胶片拷贝。
(五)EDF胶片拷贝
EDF胶片拷贝能增强条带的显色强度
1:在暗室中将干燥后的胶板置于光源上(胶面向上)
2:裁一条EDF胶片,进行曝光时间的确定
3:在红灯下,找到EDF胶片上有缺刻的一角,然后把EDF放于胶上,有缺刻的位置为左上角.在EDF上再放一干净的玻璃板。
4:根据以确定的曝光时间,对EDF曝光。
5:显影 在Kodax GBX显影液中显影1-5分钟
6:水洗1分钟
7:在Kodax GBX中定影3分钟
8:水洗1分钟.
9:烤干。
注意:
1:
鲨鱼齿插入深度不能过深,否则可上样量少,也不能过浅,否则易造成点样槽渗漏,一般插入深度以0.5毫米为好。2:一定要进行预电泳,其作用为提高胶的温度,防止DNA单链间的胶连3:上样前应用1毫升枪吸打上样孔,吸取样品应尽量不把上层矿物油带入,加样动作要快,以防止扩散。4:本实验所有部分尤其是(三),(四)、(五)三部分操作中一定要戴手套。
附录1:未知模板的用量
[200bp(PCR产物) 16ng]
[3000-5000bp(超螺旋质粒DNA4μg]
[48000bp(λ或粘粒DNA 1μg]
2:测序反应中所用聚合酶的特性
酶 持续合成能力bp 聚合速率bp/秒
Klenow片段 15-20 45
AMV 未测 5
测序酶 2000 300
Taq酶 >7600 35-100
3:引物设计要求
1):碱基组成应匀称,G+C含量为40-55%,长度为18聚。如G+C含量在此值外,则长度应为18+n/2,对于AT丰富区,n=50-(G+C)%;对于GC丰富区,n=(G+C)%-50。2),引物中不应含二重对称区,以防止形成发夹或颈环结构。3):引物纯度至少要到电泳级
4:各种溶液组成
5:ddNTP与dNTP的组成比例