酶联免疫吸附试验(ELISA)C1q测定法

1 原理包被于塑料板上的固相凝聚IgG与酶联C1q的结合受标本中免疫复合物的抑制，是一种竞争性抑制试验。为避免标本中内源C1q的干扰，应预先用IgG免疫吸附剂将其除去。

2 材料

(1) 聚苯乙烯反应板，酶联免疫检测仪。

(2) 免疫吸附剂系结合有IgG的纤维素。取纤维素(5%，pH值105)与溴化氰一起室温反应10min，用01mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH值80)充分洗涤。再与IgG一起于4℃下作用18h(20ml缓冲液中含3g纤维素和100mg IgG)。制备物用27mol/L甘氨酸缓冲液(pH值80)配成20%(W/V)悬液，贮于4℃。

(3) 酶联C1q用戊二醛法将辣根过氧化物酶标记C1q，再经超滤AmiconXM200滤膜)分离贮于－20℃。

(4) 其他试剂002mol/L TrisHCl缓冲液(pH值90)；02mol/L TrisHCl缓冲液(pH

值7.4)，以及含005%Tween20的同一缓冲液；02mol/L EDTA (pH值76)；酶底物溶液和中止液。

3 方法

(1) 包被凝聚IgG取经002mol/L TrisHCl缓冲液(pH值90)透析过夜的凝聚IgG(100μg/ml)，加入聚苯乙烯板孔内，每孔100μl，37℃包被30min后，用缓冲液洗3次(第1次、第3次用02mol/L TrisHCl缓冲液(pH值74)；第2次用含005% Tween20的同一缓冲液) ,真空干燥，贮于4℃。

(2) 取血清标本50μl，加入02mol/L EDTA(pH值76)50μl，室温作用10min，使内源C1 q游离，然后加入IgG免疫吸附剂500μl，室温振荡20min，再以500r/min离心5min，得到1∶10稀释的上清液。

(3) 取已包被凝聚IgG的塑料反应板，每孔中加入上述上清液90μl，酶联C1q10μl(1∶100 ～200稀释液)，室温下反应20min，然后用含02mol/L NaCl，005%Tween20的02mol/LTrisHCl缓冲液(pH值74)洗3次，再加入100μl底物溶液(pH值60、01mol/L磷酸盐枸橼酸盐缓冲液50ml中，加入邻苯二胺20mg，30%(W/V)过氧化氢10μl)，室温放30min，加入2mol/L硫酸50μl中止反应，于492nm读取吸光值。如果定量，可用凝聚IgG制作标准曲线，测出免疫复合物的相对含量。