酶联免疫吸附测定法呕吐毒素

呕吐毒素的介绍
脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又称为呕吐毒素，属单端孢霉烯族化合物。该毒素是F.镰刀菌霉（主要是 F.graminearum h 和 F.culmorum）的二级代谢产物，化学名为3α，3β，7α，15-四羟基镳草镰刀菌-9-烯-8-酮。这类真菌大多在低温、潮湿和收割季节，在谷物庄稼中慢慢生长。呕吐毒素一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，在黑麦、高粱、大米中的浓度较低。下表列出了世界各地各种商品呕吐毒素的存在情况。
呕吐毒素在世界各地各种商品呕吐毒素的存在情况

DON 常常与其他真菌毒素同存，从谷物和饲料中分离出来的 DON 的最高浓度已达92mg/kg。业已证明，发霉玉米中的 DON 对猪会产生毒性，对人产生食物中毒性白细胞缺乏症。动物饲料中呕吐毒素的中毒症状表现为：厌食、呕吐、消化道发炎、白血球下降、白尿、运动失调、内脏出血、中枢神经系统细胞变质，具有较强的细胞毒性，对血液及皮肤组织具有损害作用，细胞生长上表现出抑制蛋白质合成和 DNA 合成的作用。目前一些国家已制定了谷物中 DON 的限量标准，加拿大规定供人食用小麦中 DON 的限量标准为 2mg/kg，婴儿食品为 1mg/kg，美国还未建立卫生标准，但在 1982 年建议当供人食用小麦制品中 DON 含量为 2mg/kg 时应引起关注，我国也建议供人食用的谷物中 DON含量不得超过 1mg/kg。谷物中 DON 的快速测定方法有免疫亲和柱-荧光计快速分析法和酶联免疫吸附测定法。

　　在单端孢霉烯族化合物中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇由于在分子结构上存在着三个羟基，为复合抗原（毒素与载体蛋白的结合物）的制备带来了一定的困难。1988年，Casale 等人用丁基硼酸将脱氧雪腐镰刀菌烯醇分子结构中7和15位上的两个羟基先期封闭起来，通过3位上的羟基转变成琥珀酸酐衍生物，继而实现与载体蛋白的结合。运用该方法，卫生部食品卫生监督检验所制备出抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单克隆抗体，并建立了小麦中测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的间接酶联免疫吸附测定法。

　　（1）试剂

　　①化学药品：脱氧雪腐镰刀菌烯醇，四甲基联苯胺，甲醇，石油醚，三氯甲烷，无水乙醇，乙酸乙酯，二甲基甲酰胺，吐温-20，30％过氧化氢等。

　　②缓冲液系统

　　包被缓冲液 50mmol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，PH9.6。

　　洗液：含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，PH7.4。

　　样品与标准毒素稀释液：含20％甲醇的洗液。

　　底物缓冲液：0.1mol/L 的磷酸-柠檬酸缓冲液，PH5.0。

　　底物溶液：取 50μL 四甲基联苯胺溶液，加10mL底物缓冲液、10μL 130％过氧化氢，混匀。

　　终止液：为 1mol/L 硫酸溶液。

　　③脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液：用甲醇配成 1mg/mL 脱氧雪腐镰刀菌烯醇贮备液-20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用稀释液稀释成制备标准曲线的所需浓度。

　　④包被抗原：脱氧雪腐镰刀菌烯醇与载体蛋白牛血清白蛋白的结合物。

　　⑤抗体：抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇的特异性单克隆抗体。

　　⑥酶标二抗：兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物。

　　（2）分析操作步骤

　　①提取与净化 称取20g 粉碎并通过20目筛的样品，置200mL 具塞三角烧瓶中，加 8mL 水和 100mL 三氯甲烷-无水乙醇（4:1），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取 25mL 滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上挥干。用 50mL 石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250mL 分液漏斗中，再用 20mL 甲醇-水（4:1）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min，静置约 15min，收下层甲醇水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连接处塞约 0.1g 脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入 0.4g活性炭，敲紧。将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加 3mL 乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加 3mL 乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用 0.5mL 的稀释液定容，供本法检测之用。

　　②酶联免疫吸附测定 用包被抗原（20μg/mL）包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；酶标板用洗液洗3次，每次3min 后，加入不同浓度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液（制作标准曲线）或样品提取液（检测样品中的毒素含量）与抗体溶液（1:2000）的混合液（1:1，每孔100μL，该混合液应于使用的前一天配好，4℃过夜备用），置37℃，1h；酶标板洗3次，每次 3min 后，加入酶标二抗，每孔 100μL，置37℃，1.5h；同上述洗涤后，加入底物溶液，每孔100μL，37℃，30min；用终止液终止反应，每孔50μL，于波长450nm 处测定OD值。

　　③结果判定 样品检测孔所测得的 OD 值大于（或等于）阳性对照孔 OD 值，该样品为阴性，反之，则为阳性。阳性样品的毒素含量可根据下式计算。

　　毒素含量：

　　式中C—酶标板上所测得的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的量，ng，根据标准曲线求得；

　　V1—样品提取液的体积，mL；

　　V2——滴加样液的体积：mL；

　　D——样液的总稀释倍数；

　　M—样品质量，g