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PCR-ELISA

2020.9.14
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

PCR-ELISA

一、原理

PCRELISA是用免疫学方法检测PCR产物,这比常规用电泳方法及Southerlot要简便、省时,可同时处理大量标本,便于自动化。PCR-ELISA的原理是在做PCR扩增时应用生物素(biotin)标记的引物,这样PCR的产物就可结合到亲和素(avidin)包被的塑料板上,再用地高辛标记的探针与PCR产物杂交,然后就可以用抗地高辛的酶联反应检测。

二、材料、方法和结果

1.PCR扩增按基本PCR技术做DNA扩增,只是所用的引物至少有一个是5′端用生物素标记的。通常可在DNA合成仪上直接合成5′端带生物素标记的引物。

2地高辛标记的探针杂交将地高辛标记的DNA探针01μg稀释于90μl 50mmol/L TrisHCl,pH值83,80mmol/L KCl中。取10μl PCR产物加到管中,加热至90℃,缓慢冷却至67℃。离心1s,置52℃水浴保温1h。

3将杂交产物固定到塑料板上①可用商品供应的亲和素包被的酶标板,亦可用普通酶标板按常规方法将亲和素包被上;②每孔加100μl封闭液(含10mg/ml A,1mg/ml鱼精DNA的),室温1h;③T洗3次;④将地高辛探针杂交的PCR产物直接加到酶标板上,室温孵育1h;⑤T洗3次。


4ELISA检测①将抗地高辛抗体稀释于中,每孔加100μl,室温孵育1h;②T洗3次;③将酶标的第二抗体稀释于中,每孔加100μl,室温孵育1h;④T洗3次;⑤每孔加100μl酶底物,在颜色适合后终止反应;⑥在酶标仪上读结果。

三、注意事项

本法的敏感性可与放射性同位素标记相比,但又避免了同位素的危险。做大量样品时,应统一配制反应液,再小心地分装到各反应管中,以免污染,并使各管条件一致。非特异性反应常由于地高辛标记的DNA探针与酶标板直接结合所致,因此在封闭液中一定要包括足量的鱼精DNA。


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