靶细胞杀伤实验总论 2

2、流式细胞标记法
 
（1）PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法
 
正常细胞的磷酯酰丝氨（phosphatidylserine，PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早期事件，先于膜通透性增加所51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8-PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用FITC- annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞百分数。
 
本法的优点
 
①简单快捷，无需预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；
 
②与51Cr法相关性好（r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力学分析；
 
③可允许E与T长时间共育，对探讨E通过合成及分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；
 
④可用荧光显微镜观察测定。
 
（2）DIOC18（3）/碘化丙锭（PI）荧光标记法
 
用DIOC18（3）（3，3，-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）标记靶细胞膜，用红色荧光核染料PI（propidium iodide）标记效应细胞和死亡靶细胞，通过流式细胞分析可清楚区分2类细胞。在用人和猪的外周血单核细胞（PBMC）作效应细胞时可观察到靶细胞溶解百分数与不同E：T比之间存在良好相关。本法简单易行，与51Cr释放法同样敏感可信，重复性和相关性很好，另一优点是可用新制备的脾细胞作靶细胞，不再需要培养及活化靶细胞，还可测多种动物的NK活性。
 
（3）PKH-26/CFSE荧光标记法
 
Sheehy等采用PKH26和CFSE双示法可有效地标记和区分靶细胞，其标记靶细胞后的自发释放仅为51Cr释放法的1/40，因此可更准确地评价及检测少量CTL介导的细胞溶解。平行试验结是显示本法与51Cr释放法明显相关（r2=0.998，p<0.0001），对进一步研究效应细胞溶解细胞的机理具有应用价值。
 
3、树突状细胞（DC）清除法
 
Ritchie等发现抗原标记的树突状细胞DC（dendritic cell）在体内的存活与CTL活性明显相关。他们先将DC用两种不同荧光物质标记，再分为两部分，一部分用抗原标记，另一部分不标记，二者混合后注入小鼠皮下，发现只有标记了特异抗原的DC自引流淋巴结清除，未标记抗原的DC仍存于局部不受影响，改变注射部位及其他参数不影响本法测定结果。据此他们建立了这一简单灵敏体内测定CTL活性的方法。由于DC可有效摄取及呈递复合抗原、核酸及凋亡小体，本法除可测定用特异性肽负荷的DC免疫或用流感病毒感染所产生的CTL反应外，也可用于评价不具有肽表位特征的抗原的CTL活性。
 
二、报告基因转染法
 
应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β-半孔糖苷酶（β­galactosidase，β­gal）或荧光素酶（luciferase，luc）基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定CTL、NK细胞及药物介导的细胞毒和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性（代表靶细胞死亡数目），可以计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。其中β­gal半衰期较luc长，应用较为方便。
 本方法的优点：
 
1、灵敏度高，自发释放背景低；
2、用不同告基因转染的细胞系可同时测定杀伤活性，结果互不干扰，还可通过转基因小鼠进行在CTL活性研究；
 
3、用不同的基因调控元件（如组织特异性的或活性可诱导的启动子）控制报告基因的表达，可进一步深入进行机理研究。其主要不足是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力rb告基因在有些靶细胞难以转染或表达。
 
三、比色测定法
 
1、MTT（或MTS）还原法
 
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。本法简便易行，无需预标靶细胞，与51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。MTT类似物MTS在细胞内还原的 formazan产物具有水溶性，性质较稳定，其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假阳性结果。
 
2、LDH释放法
 
酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒（promega）。应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。
 
四、其他
 
1、“鸡尾酒“混合刺激法
 
Swincarski等介绍了一种测抗原特异性CTL活性方法，将外周血细胞在体外用一种含有抗原、细胞因子、共刺激分子及放射照射的饲养细胞的混合“鸡尾酒”刺激7天后，在有限稀释条件下可从微孔板快速测得抗原特异性信号。本法灵敏性高，较传统的CTL测定方法更有效，尤其是本法仅需150µl小鼠外周血而无需处死动物，因此可增加每次测定时的小鼠数量，还可在体内研究过程中于不同时间从每个小鼠多次取血测定，大大方便了CTL反应及其体内效果的相关性研究。
 
2、ELISPOT试验
 
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）通过检测抗原诱导的细胞因子（如IFN-γ）的分泌，可在体外定量测定病人PBMC中抗原特异性T细胞反应（T 细胞受抗原刺激产生并释放IFN-γ）。本法在肽特异性分泌IFN-γ的T细胞数量与细胞毒活性之间，与标准的51Cr释放法相关良好，是一种在临床试验中监测病人对肿瘤抗原的CTL或Th-细胞反应的灵敏、准确、价廉、的方法，可对肿瘤病人的抗肿瘤疫苗疗法的优化提供必要的信息。
 
以上几种CTL测定方法各有特点，其中随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现，荧光测定法将有可能取代传统的51Cr释放法，而微量和直接测定体内CTL活性的方法将为细胞免疫研究开辟新路。