细胞结构成分的离心分离技术-2

3、等密度离心法

等密度离心法（isodensity centrifugation）根据Stokes公式，当颗粒密度（ρp）等于介质密度（ρM）时，离心时颗粒悬浮于介质中不移动。等密度离心法就是根据这一原理进行的。采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，把要分离的样品放在密度梯度液表面或者混悬于梯度液中。通过离心，不同密度的颗粒或上浮或下沉，当到达与它们相同密度的介质区带时，颗粒不再移动，结果不同密度的颗粒位于各自的密度区，形成一系列区带。然后停止离心，从管底收集不同密度的颗粒。

二、细胞结构成分离心分离的实验方法

（一）实验条件的选择

（1）离心方法的选择 在进行细胞结构成分离心分离时，要根据研究对象选择离心方法。选择的依据主要是颗粒的大小和密度以及各种离心方法的特点。如果样品中颗粒的大小或沉淀系数差别很大，一般采用差速度离心方法就可达到分离的目的；如果颗粒大小差别较小，可用移动区带离心法；如果颗粒的大小差别不大而密度有差别，则应采用等密度离心法；如果两种颗粒的大小和密度都相似，就必须通过适当方法改变某种组分的性质，然后进行离心分离。另外，不同方法的特点也是考虑的因素，如差速离心法离心时间比等密度离心法短，而且所用介质浓度也比较低，对细胞结构成分的损伤和抽提都比较小，因此适用于细胞结构成分的分析分离；而等密度离心法在一定体积的介质中可以分离较多的细胞成分，适用于细胞结构成分的制备分离。

（2）介质材料的选择 理想的介质材料应该是：形成的溶液密度范围大、粘度低，对细胞结构成分损伤小，离心分离后容易去除，浓度容易测定等。常用的介质有蔗糖、甘油等亲水有机分子和氯化铯、硫酸铯等重金属盐。蔗糖和甘油溶液的最大密度是1.3×103kg/m3,能用来分离较低密度的膜性细胞器如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体等。重金属盐溶液的最大密度可达1.9×103kg/m3，可用来分离密度大于1.3×103kg/m3的分子，如DNA、RNA、核糖体等。由于重金属溶液密度很大，在离心力场中会自动形成密度梯度，用来分离的物质可直接与重金属盐溶液混合，然后进行等密度离心。

（二）细胞器的分离

（1） 细胞器的释放 在分离细胞器之前必须破碎细胞、释放细胞器。破碎细胞的方法有低渗处理、超声振荡、冻融、用匀浆器打碎等多种细胞匀浆，但最常用的方法还是细胞匀浆，即采用机械方法破碎细胞使其匀浆化，滤去细胞碎片后制成细胞器悬液。

（2）细胞器的初步分离 用差速离心法分离各种细胞器。先用500～1000×g离心，使大的细胞组分沉降，沉淀中主要是细胞核，还包含一些细胞碎片；将第一次离心的上清液用10000～20000×g离心，使中等大小的细胞器沉降，沉淀中包含线粒体、溶酶体和过氧化物酶体；将第二次离心的上清液再用更高的速度（～100000×g）离心，使小的细胞器如微粒体、内质网、高尔基体和质膜沉淀，上清液中剩下胞质溶胶的有关成分。细胞器在每一步离心沉淀中的分布可随离心速度和时间的不同而有一定差别。一般说来，用差速离心分离的细胞器不是很纯的，要获得比较纯的细胞器必须把初步分离的细胞器进一步纯化。

（3）细胞器的纯化 可采用不同的方法进一步将初步分离的细胞器纯化。如线粒体、溶酶体和过氧化物酶体虽然大小相近，但密度不同，可用等密度离心进一步分离；细胞核部分则可用高密度蔗糖溶液（2.0mol/L）的差速离心法来纯化。对分离细胞器纯度的鉴别主要有两种方法：一种是电镜作形态鉴别；另一种方法是生化分析，因为已知每种细胞器都含有某些特殊的分子，可作为标志用于鉴定细胞器（表2-1）。

细胞器分离纯化后，一方面可对细胞器的化学组成、酶活性和代谢特点进行分析，另一方面可将分离的细胞器在体外进行该细胞器的功能实验，称为无细胞系统( cell free system )实验。目前有关细胞器结构与功能以及细胞中的重要反应过程的资料，如蛋白质合成机制、蛋白质分选和运输等，有不少来自分离细胞器的生化分析和无细胞系统实验。