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JAM检测技术检测原理和实验方法

2020.9.15
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

JAM检测技术是用于测定细胞死亡或凋亡的方法,如51Cr稀放法事基于细胞死亡往往伴随有细胞膜破裂及细胞质的释放,用51Cr或125I标记相关的靶细胞,与效应细胞共培养一定时间后,测定一定体积的培养上清中的放射性计数,以反映细胞损伤情况。而人们发现,细胞死亡的早期反应,细胞内DNA被酶裂解成180kb左右的小片段,这一变化发生在细胞膜破裂之前,因而在由CTL介导的细胞死亡早期,靶细胞首先表现为出现DNA碎片。检测出靶细胞的DNA碎片,对于CTL介导的细胞死亡应是一个更为灵敏、准确的方法。Duke等人曾用差异离心的方法进行检测,但这一方法比较费时,不适合应用于较大样品量的常规检测。而Matzinger发现,可以用3H-TdR标记检测细胞增殖的方法加以改进来检测。
(一)检测原理:
用真空抽吸玻璃纤维滤纸上被3H-TdR标记的靶细胞,以测定靶细胞DNA断裂及细胞死亡。由于DNA被抽吸的过程中,DNA碎片可以通过抽吸穿过滤膜,因此只有来自于活细胞的完整的DNA被留在滤膜上,通过测定其cpm读数,即可了解细胞DNA被损伤的程度以及细胞死亡情况。
(二)实验方法:
1、靶细胞的培养及标记:
靶细胞(通常为肿瘤细胞如P815),通常在培养瓶中,用适宜的培养基,37℃、5% CO2条件下培养,实验前1天将其按(2.5-5)×105个/ml的浓度接种至24孔板中,培养1天后,向培养基中加入3H-TdR进行标记,使终浓度为2.5-5uCi/ml,不要搅动细胞,在37℃、5% CO2条件下继续培养一定时间,直至使用前。对于生长较快的靶细胞,培养4-6h即可标记,一般则培养过夜。
2、效应细胞的培养:
常规分离获得的C57BL/6大鼠脾细胞,按4×106个/空接种于24孔板中,以300Gy照射过的BALB/C大鼠脾细胞作为刺激细胞,培养5天后,于测试前将细胞收集按一定细胞数重新接种于96孔板中,100ul/孔,并进行一定稀释以达不同的效/靶比(R/T),每组至少设3个平行孔。
3、效应细胞、靶细胞作用:
靶细胞标记结束后,轻轻地将细胞吸出,洗涤1次,再按1×105个/ml浓度重悬,向已含有效应细胞的96孔板中加入100ul/孔的靶细胞,在37℃、5% CO2条件下共同孵育1-4h。
4、收获:
培养结束后,可用目前收集细胞用的细胞收集器将细胞及其培养基抽吸到玻璃纤维滤膜上,依次用双蒸水。三氯醋酸、无水乙醇洗涤及固定滤膜,烘干后,加入闪烁液,用液闪计算仪进行测定。
5、计算特异性杀伤率(%):
特异性DNA杀伤率(%)=[(S-E)/S]×100%

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