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DNA双链断裂检测——变压场凝胶电泳(GFGE)

2020.9.15
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

DNA双链断裂与细胞死亡的关系更为密切。变压场凝胶电泳是采用将细胞包埋在低熔点琼脂糖凝胶中,通过蛋白酶、去污剂等渗入凝胶中融解细胞、去蛋白,纯化细胞DNA,再通过梯增电压进行琼脂糖凝胶电泳,结合DNA解旋荧光测定(FADU)法和检测DNA双链断裂。

1、主要试剂及配制方法:
(1)蛋白酶K,SDS,低熔点琼脂糖。
(2)配制方法:
细胞缓冲液(A液)。0.25mol/L NaCl + 10mmol Na2HPO4 + 1mmol/L MgCl2,pH7.2.
细胞裂解液(B液)。9mol/L脲 + 10mmol/L NaOH + 2.5mmol/L环烷二胺四乙酸 + 0.1%SDS。
碱性变性液I(C液)。B液 + 0.2mol/NaOH,体积比为45:55.
碱性变性液I(D液)。B液 + 0.2mol/NaOH,体积比为40:60.
抗变性液(F液)。1ug/L溴化乙锭 + 13.3mmol/NaOH.

2、实验操作步骤:

(1)DNA双链断裂的FADU测定:
分别取对照组和处理过的细胞2 x 10^5个加入试管内,对照管设T管(未变形)、B管(空白)、P管(部分变性)3组,处理过的细胞仅设Pi组,每组3个平行样品,,各加0.2ml细胞裂解液,0℃裂解细胞10min。
细胞裂解后,T管加E液(抗变性液)0.4ml,其他各管沿管壁缓慢加入0.1mlC液和0.1mlD液,不混匀,置0℃避光30min。
B管超声处理20s置15℃ 45min。
降为0℃后,P管、B管加E液0.4ml,混匀后T管、P管超声处理5s。
各加入F液1ml,混匀后,室温下用荧光分光光度计测量相对荧光强度(激发光520nm,发射光590nm)。
结果计算。

(2)DNA双链断裂的GVGE测定:
细胞DAN准备。收集细胞,用PBS洗涤并悬浮,调整细胞浓度为1 x 10^7个/ml,与等体积1.2%低熔点琼脂糖混合后制成小块,细胞胶块悬于含有不同浓度处理因素的培养基中,37℃孵育15-30min后将细胞胶块置于2mg/ml蛋白酶K、1%SDS、0.5mol/LEDTA、10mmol/L Tris-HCl的裂解液中,50℃,24h,融解细胞,去蛋白。然后用TE缓冲液清洗胶块,置于0.5mol/L EDTA中4℃保存待电泳。
电泳。电泳凝胶为0.9%琼脂糖,胶块大小10cm x 11.5cm x 1cm。取上述制备的DNA样品胶块放入电泳凝胶的加样孔中,用0.9%琼脂糖封固以防气泡,置于含45mmol/ Tris-硼酸、1.25mmol/L EDTA,pH8.0的电泳缓冲液中,逐渐升高电压,0.6V/cm x 40h,1.5V/cm X 7h,3.0V/cm x 2.5h,电泳完毕,取出凝胶。
照相图像分析。将上述凝胶在紫外灯下照射,同时,凝胶块用图像仪进行分析,显示样品DNA进胶盒残留在原点的分布状况,浸入凝胶的DNA即为双链断裂DNA。


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