细胞凋亡(Apoptosis) 又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。即是在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自主结束生命的死亡方式。
凋亡一词最早是由年澳大利亚组织病理学家John Kerr通过研究大鼠肝左叶细胞死亡时，于1972首先提出的。
凋亡与坏死的形态特征不同，拿凋亡研究比较清楚的动物细胞来讲，坏死细胞首先表现为胞膜通透性增加，细胞外形发生不规变化；内质网扩张；核染色质不规则位移；线粒体及胞核肿胀；溶酶体破坏；胞膜破裂胞浆外溢；最后被巨噬细胞吞噬。细胞坏死常引起周围炎症反应。而凋亡细胞形态变化为：细胞变圆，与邻周细胞脱离；胞膜表面微绒毛减少或者消失；核质固缩(Condensation)，边移(Margination)；胞浆坚实(Compactness)；细胞器集中(Squeeze)；胞膜芽生(Bud)；凋亡小体
(Apoptotic-body)形成，最后被巨噬细胞或者邻近吞噬细胞吞噬，或排入体腔例如腺腔及血管腔等。这种死亡过程中，不发生溶酶体，线粒体及胞膜的破裂，没有内涵物的外泄，故不引起炎症反应及周围组织的次级损伤。在凋亡中细胞中有显著的生化变化即DNA片段化，胞内钙离子浓度增高以及酶学改变。DNA的特征性降解发生在凋亡的早期，它是由于内源性核酸内切酶基因的活化和表达而造成的结果，凋亡的染色质DNA
的断裂大部分是单链断裂，染色质DNA断裂的位置绝大部分位于核小体间的连接部位，因此容易造成核小体间散布着一系列单链切口，核小体之间被核酸内切酶随机分解，产生180～200
bp或其整数倍的DNA片段，在1.5%～1.8%琼脂糖中电泳呈特 征性的梯形带(Ladder
Patter)。目前已比较清楚的凋亡中活性发生明显变化的酶主要有核酸内切酶、转谷氨酰胺酶、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)
在动物细胞中，细胞凋亡常常是对环境信号反应的结果。细胞凋亡的正性触发因子包括：①物理因素
：γ射线，紫外线，加热等；②糖皮质激素；③细胞毒药物：放射菌素，氨甲喋呤，顺铂，阿糖胞苷等；④受体：APO-1/FAS抗体的受体，TCR-CD3特异抗体的受体；⑤引起cAMP水平升高的化合物：cAMP及其衍生物，霍乱毒素，茶碱；⑥细胞因子TNF-α及TGF-β等。
细胞凋亡的负性触发因子主要是一些生长因子包括NGF，CSF(G-CSF，GM-CSF)，IL(IL-2 ，IL-3，IL-4，IL-6)等。
与动物细胞相比，植物细胞的凋亡研究起步不久，但国外的一些研究结果证明,植物细胞中存在明显的凋亡过程。凋亡同样是植物发育及对环境应答中一个必要的主动死亡过程。在发育过程中,PCD消除那些已完成其自身使命后对植物体不再有用的细胞，如胚发生过程中原始的胚柄细胞、种子萌发后糊粉层细胞、叶裂片过程中无用的细胞、单性花中原始的雄蕊、根冠细胞等。在某些病理防护反应中，凋亡可以消除那些被感染细胞及未感染但发生超敏反应的细胞。在逆境中许多逆境因子将诱导植物细胞的凋亡。植物蛋白酶、RNase和脂肪氧化酶可能参与植物细胞凋亡。
细胞凋亡近年已形成了相当的热潮。在衰老调控、肿瘤防治、新药开发，植物抗逆、抗病品种选育，转基因动植物的生理变化及安全性方面，细胞凋亡研究将大有作为。
目前凋亡细胞的检测方法主要有：1、形态学观察，细胞凋亡时有其典型的形态学改变，例如体积缩小变圆，胞浆浓缩，核固缩边集在核膜下呈月牙状或腰带状，胞膜芽生，凋亡小体形成；2、流式细胞仪检测
1）流式细胞仪单荧光和双荧光染色法，细胞发生凋亡时，细胞的通透性增加，但其程度介于正常与坏死之间。被检测细胞悬液用荧光色素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度即可区分为正常细胞，坏死细胞及凋亡细胞。利用碘化丙啶(PI)单染，细胞凋亡可出现亚G1峰。用Hoechest-PI双染，正常细胞对染料有拒染性，萤光着色浅，凋亡细胞主要摄取Hoechest染料呈现强兰光，而坏死细胞主要摄取PI呈红色荧光。流式细胞术是进行凋亡细胞定量的较好的方法，可作凋亡定量分析，但其漏检及错检率都很高。漏检主要发生在S期或G2/M期的凋亡细胞，这些细胞即使有DNA含量降低，但其实际存有的DNA含量并不
低于二倍体细胞所含的DNA的量，因而不会出现亚G1峰。错检的原因是一部分细胞碎片或小颗粒发生低荧光位于亚二倍体区。2）DNA和蛋白质染色，凋亡细胞保持细胞完整性直到晚期，坏死细胞则较早出现膜的破裂分解，因此坏死细胞DNA和蛋白质含量较凋亡细胞为低，用DNA和蛋白质的特异萤光染色，以DNA的荧光强度作为X轴，蛋白质的荧光强度作为Y轴作二维图，则坏死细胞位于二维图的左下方，凋亡细胞位于右上方。3）DNA末端转移酶标记技术(TUNEL)的流式细胞仪分析，细胞凋亡时，DNA被内源性核酸内切酶降解，产生带有3′末端的DNA片段，在末断脱氧核苷酸转酶介导下，使标有萤光素的核苷酸连接到DNA片段的3′末端萤光强度与DNA片段含量成正比，根据荧光强度对凋亡细胞作出定量分析。该方法检测与凋亡相关的DNA降解片段的特异性和敏感性比琼脂糖凝胶电泳高的多，它能检出少于2¡103～5¡103个细胞的DNA断链；4、FITC-Annexin
V/PI双染法，细胞膜内的磷脂酰丝氨酸暴露到膜外是细胞凋亡的早期事件之一，AnnexinⅤ是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与磷脂酰丝氨酸具有高度的亲和力，因此它可以作为探针检测暴露在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸，将Annexin
Ⅴ标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC)，同时结合使用PI拒染法进行凋亡细胞双染后进行流式细胞仪检测。该方法是检测早期凋亡细胞的快速方法；5琼脂糖电泳分析，凋亡细胞DNA片段为180～200
bp的倍数，而坏死细胞断裂为无特征性的杂乱片段，因而凋亡细胞DNA电泳带呈特征性的梯形带，而坏死细胞呈弥散性模糊泳带。该方法简单、方便。但其最大的局限性是对细胞凋亡只能定性不能定量，实验中常用1.5%～1.8%的琼脂糖凝胶电泳；6、DNA片段原位标记法，细胞发生凋亡时，由于其DNA断裂为内源性的DNA内切酶激活所致，其断端3′端的羟基暴露，在TDT酶的作用下，将标记的脱氧核苷酸，连接到3′端，通过荧光或化学显色反应，可以原位地显示发生凋亡的细胞。由于细胞坏死时其DNA断片是不规则的，一般产生的3′端羟基末端DNA片段量少，不易检测出来，但有时也会出现阳性结果，因而需结合细胞的形态学特征加以判断。由于DNA降解是凋亡的早期事件，因而该方法可以检测到早期的凋亡细胞，且有较高的敏感性与一定的特异性，在凋亡的研究中得到广泛的应用。
本实验拟通过用地塞米松诱导动物细胞凋亡，高盐胁迫诱导植物原生质体细胞凋亡及凋亡细胞的检测来了解掌握凋亡知识。
一仪器：光照培养箱、二氧化碳培养箱，显微镜
二试剂：各种培养基、地塞米松
三操作
1：分离动物细胞和植物原生质体
2：加入诱导剂进行细胞预培养数小时
3：根据第一部分实验技术提取DNA
4：培养细胞显微镜观察
5：1.5%琼脂糖凝胶电泳分离DNA梯形图。
首页
