实验方法原理 | Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、Western blot 分析Procaspase-3的活化,以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解。 1. 方法 收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭,室温1.5~2 h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2 h或4°C过夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次,5~10 min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2 h→ TBS-T洗3次, 5~10 min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。 2. 结果
1. 原理 2. 方法
3. 结果 三、流式细胞术分析 1. 方法
2. 结果 展开 |