3M高灵敏度大肠菌群测试片操作以及判读
一、高灵敏度大肠菌群测试片 操作方法
1. 未开封时，冷藏于≤8℃（≤46℉），并在保存期内用完，高温度时，凝固水可以排除，包装物最好于室温启开。
2. 已开封的，将封口以胶带封紧。
3. 已启开的包装袋不要冷藏并于一个月内使用完。
4. 制备食物样品稀释液，称取或吸取食物样品，置入适宜的无菌容器内，如均质袋、稀释瓶、WhirlPak bag或者其他灭菌容器内
5. 加入适量的无菌稀释液,包括Buffered peptone Buffer(IDF phopsphate buffer ,用0.0425g/L的KH2PO4调PH7.2) 、0.1%的旦白胶水(ISO方法6887) 、缓冲旦白胶水(ISO方法6579) 、盐溶液(0.85-0.90%)、bisulfite-free letheen broth或蒸馏水.但不可用含有枸橼酸盐、bisulfite or thiosulfate的缓冲液. 因为它能抑止菌生长。
6、搅拌或均质样品.
样品的稀释液调PH6.6-7.2对酸性样用IN NaOH、碱性样用INHCI调PH。
7、将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜。
8、使用吸管将1ml样液垂直滴加在测试片的中央处。
9、细心将上层膜缓慢盖下，避免有气光泡产生，切勿使上层膜直接落下。
10、使用压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处。
11、轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。
12、拿起压板，静置至少1分钟以使培养基凝固。
14、可目视及用标准菌落计数器或其它的照明放大镜计数，并可参考判读卡计算菌落数。
15、可以分离菌落作进一步鉴定，即掀起上层膜，由培养胶上挑取单个菌落。
13、测试片的透明面朝上，可堆叠至20片。培养时间和温度因方法而有不同，最通用的认可方法是：
总大肠菌群
● AOAC官方方法986.33和989.10（乳/生乳和其它乳制品）
大肠菌群：32℃±1℃培养24±2h
● AOAC官方方法991.14（食品类）
大肠菌群：35℃±1℃培养24±2h
● NMKL方法（147.1993）
大肠菌群：37℃±1℃培养24±2h
● AFNOR认可方法3M 01/2-09/89A和B（除水生贝壳类动物外的所有食品）
大肠菌群：30℃±1℃培养24±2h
耐热的（粪）大肠菌群
● AFNOR认可方法，3M 01/2-09/89C（所有食品） 44℃±1℃培养24±2h。当提高培养温度时，培养箱应有一定的湿度是需要的。
二、高灵敏度大肠菌群计数测试片 判读方法
Coliform count = 4?
Coliform count = 13
在PetrifilmTM 高灵敏度检验测试片上菌落计数相当容易。测试片中的指示剂使革兰氏阴性菌染成红色，上层膜能截留大肠菌群产生的气泡，当大肠菌群大量产酸时，菌落周围会产生粉红色的菌晕。所以，计数红色带有气泡的菌落为大肠菌群，菌落周围的粉红色菌晕使计数更加方便。
Coliform count = 30
圆圈1, 2和3中的气泡形状有所不同。圆圈1中的气泡和菌落相邻；圆圈2中的气泡撑破了菌落，使菌落看似气泡的“轮廓”；圆圈3中的菌落被3个小气泡围住。细菌学手册上规定，红色不带有气泡的菌落不计作大肠菌群。
Coliform count = 0
注意图4至图9中培养基颜色的变化。随着大肠菌群数和产酸的增加，培养基的颜色由淡桔黄色(图4)逐渐向明显的粉红色(图9)转变。同时做阴性对照有助于区分培养基的颜色。
Coliform count = 90
Estimated coliform count = 320
圆形的生长面积约为60 cm2。当菌落数大于150个时，可选择1个或多个代表性方格来估算菌落数。计算每个方格的平均菌落数后乘以60，即为估算的大肠菌群数。
Estimated coliform count = 840
在接种区边缘的菌落和气泡可能较小，且边缘培养基外观略有差异，但不会影响菌落的计数。见图7。
Coliform count = TNTC
在PetrifilmTM高灵敏度检验测试片上，当菌落数过多时难以计数，该现象称为TNTC (Too Numerous To Count) 现象。该现象伴有以下特征：许多小型菌落和气泡，有时培养基颜色会加深。见图8。
Coliform count = TNTC
图9中，测试片上有许多小型菌落，培养基颜色变深，为TNTC现象。
Coliform count = 2
食品颗粒通常呈不规则形状，且不带有气泡。见圆圈1。在测试片上，人为的气泡可能由于接种不当引起，其形状不规则，且不带有红色菌落。见圆圈2 。
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