2020年7月29日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队，中科院上海生化与细胞所许琛琦团队、美国加州大学圣地亚哥分校惠恩夫团队，联手在Cell上发表了题为“Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的论文，该研究通过开发基于质谱的绝对定量蛋白质组新方法，揭示了T细胞受体-共受体（TCR-CD3）复合物酪氨酸在不同抗原刺激下的动态磷酸化修饰全貌，解析了不同CD3链ITAM结构域磷酸化特征的奥秘，从中发现了其中一条亚基CD3ε的单磷酸化新功能，有望助力于设计全新的CAR-T疗法。
TCR-CD3复合物在T细胞的发育、激活及对病原的免疫反应中起着决定性作用。这一重要作用来自于CD3链胞内端的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif-ITAM)。而ITAM的多样性功能主要取决于其结构域的酪氨酸（Tyrosine）磷酸化，比如招募SYK激酶家族蛋白ZAP70进而激活下游的信号传导。另外，ITAM的功能也被广泛应用在对嵌合抗原受体（CAR）的研究中。其中CD3ζ亚链便常用于构建CAR-T细胞疗法抗肿瘤活性，但其他CD3链的功能和对于CAR的设计也还有很多未知。
深入探索 CD3 ITAM的酪氨酸动态磷酸化模式可为全面理解不同CD3链的功能提供核心信息。TCR-CD3受体复合物有10个ITAM结构域分布着20个磷酸化位点，在时间分辨率下实现对全部磷酸化位点的同时定量分析在技术上极具挑战性。为了直观比较不同TCR刺激下的磷酸化模式，精确绘制出TCR所有酪氨酸磷酸化的动态过程，黄超兰团队开发了一种新颖的绝对定量方法 Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass Spectrometry（TIMLAQ-MS）。区别于目前报道的蛋白组绝对定量手段，不需要加入同位素重标的合成肽段，而是巧妙地利用串联质量标签（TMT），设计将6个标准样品和4个分析样品混合起来作为内标。标准样品为不同浓度梯度的合成非重标磷酸化/非磷酸化CD3肽（A）和从未经抗原刺激的T细胞中通过IgG抗体免疫沉淀下来的背景蛋白（B）的混合物；用数据依赖采集（Data-dependent acquisition, DDA）结合平行反应监测（Parallel reaction monitoring, PRM）的方式获得抗原刺激下，TCR-CD3免疫沉淀（IP）复合物中不同酪氨酸位点的磷酸化/非磷酸化在不同时间点的定量结果。 TIMLAQ成功绕过了以前的定量方法中通常使用的同位素重标记肽，既节约了成本，又有效降低了方法的复杂性和数据采集误差，进一步提高了定量准确性，最终可完全实现在一次测量中对不同时间点全部ITAM磷酸化修饰的绝对定量，描绘TCR-CD3复合物的酪氨酸动态磷酸化修饰全貌。
基于TIMLAQ-MS法的CD3 ITAM磷酸化修饰鉴定
利用这一方法鉴定到在不同的TCR刺激条件下，CD3各亚基主要表现为双磷酸化修饰模式，而唯独CD3ε呈现出单磷酸化修饰模式。前研究表明，双磷酸化的ITAM与激酶家族蛋白ZAP70有很强的结合而激活下游信号传导，而单磷酸化的ITAM则表现出很低的结合性。本文中 这一特殊的新发现驱使作者进一步深入探索CD3ε在TCR通路中的新潜在功能。结果显示，单磷酸化的CD3ε可通过专门募集抑制性Csk激酶减弱TCR信号传导， 说明TCR中既有激活基元又有抑制基元，总体呈现为一种自制的信号传导机制。作者团队进一步深入研究，发现一旦将CD3ε细胞质结构域整合到第二代CAR中，CD3ε的ITAM结构域可以通过募集Csk减少CAR-T细胞因子的产生，而CD3ε的BRS结构域则可以通过募集p85促进CAR-T细胞的持久性。总体而言，将CD3ε应用于CAR的设计可显著提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
从一个重要的基础生物学问题开始，为解决问题而开发一个新颖方法，得到新发现，再深入探索生物学功能，最后有望贡献在治疗方法上。黄超兰教授，许琛琦教授和惠恩夫教授作为本文的共同通讯作者，完美地演绎了不同交叉领域共同合作而产生的精彩结果。
黄超兰教授是北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任，北京大学医学部基础医学院长聘副教授，北京大学生命科学联合中心研究员，曼彻斯特大学荣誉教授。近年来，黄超兰教授带领团队积极开发基于质谱的蛋白质组学新方法，实验室拥有国际领先的仪器、技术和方法，致力于为生物学和临床研究中遇到的难题提供最有质量保证的全面蛋白质组和质谱技术手段。
仅从2015年至今，黄教授在高影响因子的杂志上就发表了近50篇文章 （目前已累计发表SCI论文80余篇），不但自己开发最前沿的质谱技术（迄今为止，课题组研发的单细胞蛋白质组技术，在单一体细胞中鉴定的蛋白数量是 全球领域最高水平），更发挥了强大的合作力量，以她高超的质谱技术助力了众多科学家的科研发展。曾协助美国普林斯顿大学教授，美国科学院外籍院士颜宁课题组，利用质谱技术有效分析了ACAT1蛋白周围游离的脂质，为ACAT1作用底物的鉴定提供了最为直接有效的证据，相关工作发表在Nature上1。最重量级的是协助中科院院士，西湖大学校长施一公教授利用高分辨交联质谱技术对剪接体复合物的成分和相互作用进行准确鉴定，促进了剪接体复合物在冷冻电镜上的超高分辨率结构鉴定，相关工作发表在两篇Science上2，3。
参考文献：
1 Qian et al., Nature, 2020; 581(7808):333-338
2 Yan et al., Science, 2015; 349(6253):1182-1191
3 Wan et al., Science, 2016; 351(6272):466-475
人物简介 黄超兰
香港大学物理化学博士（质谱机理，研究多肽的质谱气相热动学及其裂解途径）。
2003-2004年期间担任香港大学生物制药发展中心（BDC，HKU）及香港特区卫生署之间的合作项目的负责人，为香港政府建立了一个全新的配备了各种先进的分析仪器的标准化实验室，建立了香港政府的第一本中药药典。
2005年-2013年，在美国斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute ) ，蛋白质组学领域开创者John R Yates教授实验室做访问学者，博士后研究员，从事基于质谱的蛋白质组学前沿新技术和方法的研究开发工作。2007年被留任为斯克里普斯研究所的职位科学家(Staff Scientist), 两年后晋升为资深职位科学家(Senior Staff Scientist) 和质谱实验室总管。并一直担任美国国家中心研究资源的酵母资源中心( Yeast Resources Center, YRC）和斯克里普斯研究所生理蛋白质组学研究中心（Center for Physiological Proteomics）的首席科学家。
2013年被中科院人才引进回国，建设中科院国家蛋白质科学中心，任职质谱系统主任，中心主任助理，管理整个中心的技术部门。
2017年被北大医学部人才引进，组建北京大学医学部精准医疗多组学研究中心，担任中心主任。全面深入接轨技术与临床，研究疾病问题。
2018年12月13日，黄超兰教授被聘为“北大－清华生命科学联合中心”研究员。
黄教授是个善于整合多学科专家，战略规划和人员管理的全方位技能的科学家，长期致力于质谱和蛋白质组学前沿新技术和方法的研究开发，包括用于研究基础科研和临床应用。
曾首次鉴定体内精氨酸化修饰底物Beta-actine，填补了精氨酸化翻译后修饰领域的空白。目前开发的单细胞蛋白质芯片gOAD chip (3.0) 的方法在2020年在国际单细胞蛋白质组会议上被认可在单一体细胞中鉴定的蛋白数量最高的方法，相关研究成果被Analytical Chemistry亮点报道。2020年在Cell上发表了基于质谱的绝对定量蛋白质组新方法，全面解析了TCR-CD3复合物的酪氨酸动态磷酸化修饰全貌，助力于设计全新的CAR-T细胞疗法。其他的研究方向包括基于临床大队列，利用4D-DIA高通量技术开发疾病标志物和解析疾病机制完成临床血浆标志物定量的标准程序（benchmark）
在Cell、Science、Nature Method、Nature Communications、PLoS Biology、PNAS、Molecular Cell、EMBO J等期刊发表超过80篇文章。2014年获选为“中科院引进杰出技术人才”。
主要研究方向：一，开发以质谱为核心技术的前沿方法。目前专注的研究项目为：1）单细胞蛋白质组学技术开发及其在生物医学中的应用； 2）基于新型捕获离子迁移谱质谱（TimsTOF）的糖蛋白鉴定与定量方法； 3）基于碰撞横截面数值（碰撞截面）的数据独立采集方法开发。二，利用基于质谱的蛋白质组学及其他多组学技术的整合，辅以生物，化学生物学等其他跨学科领域的技术和手段，大规模地发掘基于疾病问题和临床病理的生物标志物，同时完成功能验证和机制解析。
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