1.技术背景
米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种可以引起食物中毒的呼吸系统性毒素。其结构如下图所示，它是一种脂溶性酸性化合物，主要产生于谷类发酵制品、变质椰子食品及鲜银耳类产品中，摄入受其污染的食物会引发中毒，严重可致死亡。
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目前市面上常用方法以及国标规定方法为固相萃取柱净化和液液萃取的净化方法，可能会面临操作复杂、有机试剂消耗大、干扰多、回收率低等问题，Pribolab技术研发中心基于现有的标准方法的不足和局限性，建立了多功能净化柱“一步法”净化，可用于液相色谱二极管阵列检测器或液相色谱串联质谱检测食品中的米酵菌酸残留，具有前处理简单快速、环保低有机试剂消耗、回收率高，净化效果好的特点，适用于各类食品基质中米酵菌酸的测定。
2.实验方法
参考食品安全国家标准-食品中米酵菌酸的测定（GB 5009.189-2016），优化前处理方法，使其适用于“一步法”快速高效净化。
2.1实验试剂耗材
Pribolab® 500μg/mL米酵菌酸标准物质（乙腈）
Pribolab®·ODS·C18 液相色谱柱
PriboFast® MFC 335多功能净化柱
PriboFast玻璃纤维滤纸
乙腈水提取液：量取84 mL乙腈用水定容至100 mL，混匀备用。
2.2样品制备与提取
干试样经粉碎过筛，湿试样经充分均质，称取25.0g试样置于锥形瓶中，加入100mL乙腈水提取液，混匀，超声提取30min，5000 r/min离心5分钟或用玻璃纤维滤纸过滤，待净化。
2.3试样的净化
取8mL上清液加入透明玻璃管中，使液体通过PriboFast® 335多功能净化柱完成净化。取净化后的溶液过滤膜后上液相或液质分析。
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3.液相液质条件
液相色谱条件
液相质谱条件
色谱柱：Pribolab真菌毒素专用色谱柱C18(4.6*250 mm,5 μm)
Pribolab真菌毒素专用色谱柱C18（2.1*100 mm,1.8 μm）
流动相：甲醇+水（1%乙酸）=80:20
0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脱
柱温：30℃
30℃
进样量：20μL
1μL
流速：1ml/min
0.3μL/min
检测器：267nm
ESI-MRM，负离子模式
4.实验结果
4.1实验谱图
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图1 米酵菌酸液相色谱图
图2米酵菌酸液质TIC图
4.2结果分析
米酵菌酸结构式含有3个羧基（-COOH），酸性较强，容易丢失质子而带上负电荷，其保留因子和选择性受pH值影响大，当流动相条件为酸性时可避免离子化从而得到对称色谱峰。因此液相色谱采用甲醇+1%乙酸水（80:20）为流动相，分离效果好，方法检出限为0.2μg/g。在液质检测中0.1%甲酸水-乙腈为流动相，同样酸性环境抑制了米酵菌酸的电离，使其以分子形式存在，在反向固定相中的保留增强，且减少了与固定相中残存硅醇基的结合，有助于改善峰型，方法检出限0.1μg/kg。
本次实验选取了常被米酵菌酸污染的食品酸汤子、米粉、银耳进行加标实验验证，加标水平2 mg/kg,每种加标做6个平行。结果如下表所示。
米粉
银耳
酸汤子
平均回收率(%)
88.77
92.46
83.41
相对标准偏差（%）
3.8
2.4
3.1
5.结论
本实验建立多功能净化柱“一步法”净化食品中的米酵菌酸，具有前处理简单高效，回收率高的特点，适用于液相以及液质方法检测米酵菌酸残留，对食品风险监测和相关标准的制定具有指导意义。
实验耗材采购指南
货号
名称
规格
STD#8050
Pribolab®500 µg/mL米酵菌酸(Bongkrekic Acid)/乙腈
1.2mL
MSS1084
pribolab®米酵菌酸（Bongkrekic Acid)
0.5/1.0mg
EH04072
Pribolab® ODS C18 液相色谱柱
4.6mm*150mm 5um
EH04073
Pribolab® ODS C18 液相色谱柱
4.6mm*250mm 5um
M3005
PriboFast®MFC335固相净化柱
5mL
GF/A-100
PriboFast 玻璃纤维滤纸
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