合成生物学作为迅速发展的交叉学科，已在生物医药、新材料、诊断、能源和数据储存等领域展现越来越广泛的应用潜力。合成基因组学作为合成生物学的重要研究方向，着重于新生命体系的从头设计与合成，其以Oligo（寡核苷酸链）合成、拼装和转移等核心技术为支撑。新生命体系的从头设计与合成不仅需要合成组成基因组的小片段DNA片段，还需要通过后续的组装与拼接获取完整的合成基因组。Oligo合成及基因组DNA拼装、转移技术是合成基因组学乃至整个合成生物学领域的核心技术体系，今天主要来介绍体外单链DNA（Oligo）合成与双链DNA拼接组装技术。
1. 单链Oligo合成技术
Oligo即寡核苷酸链，分子实验室常用的PCR引物、NGS捕获探针、qPCR探针和FISH探针等都是Oligo。与双链DNA相比，Oligo有个一个共同的特点他们都是单链DNA序列，根据功能不同，可以在Oligo上修饰荧光基团、化学基团（如，羧基、氨基、巯基等，）等。根据合成原理，目前Oligo的合成方法可分为已经成熟并商业化的化学合成法和正在研发中的酶促合成法。
1.1 化学法
Oligo的化学合成研究始于20世纪50年代，Michelson和Todd首次报道采用磷酸二酯法实现了寡聚二核苷酸的合成。到20世纪80年代，Beaucage和 Caruthers开发了基于亚磷酰胺的DNA合成方，即今天Oligo自动化生产所采用的主要方法。该方法包括去保护、偶联、加帽（可选）及氧化 4 个步骤 （图 1）。由于随着链延长所带来的化学反应效率、合成纯度以及产率的下降，目前该方法合成的Oligo长度一般不会超过200个核苷酸（nt）。为了提高通量，从20世 纪90年代开始发展起来的基于微阵列芯片的DNA合成策略，使得合成成本降低了若干个数量级。然而由于芯片特有的不均一性及边缘效应等原因，相较传统的柱法合成，芯片法合成在长度、准确性方面均有所下降。为了增加芯片合成的精确度，科学家采用不同的技术策略，从各异的芯片产物中挑选出正确合成的寡核苷酸原料。Kosuri采用了多重PCR策略，选择性扩增目的寡核苷酸片段，结合酶促纠错等方法，可以合成长度超过200 nt的寡核苷酸原料，实现了更大规模和更高精度的合成。
图 1.固相亚磷酰胺法从头合成寡聚核苷酸链的4步反应
4步反应包括：（1）去保护。酸催化去除 DMT（二甲氧基三苯基甲基）基团，以便下一轮碱基（dA、dC、dG和dT）添加。（2）碱基偶联。将含有DMT保护基团的亚磷酰胺通过四唑活化剂加到未保护的5′OH末端。（3）加帽。将游离的5′OH乙酰化，以防止进一步的链延伸所造成的单碱基缺失。（4）氧化。通过碘液将磷酸三酯氧化为磷酸盐，进入一个反应循环.
1.2 酶促从头合成法
目前亚磷酰胺法是商业化Oligo合成的主流方法，但其合成的长度限制在200nt左右，而且合成过程中亦会大量使用有毒化学试剂。由于在合成准确性及不需要使用毒性化合物等方面的潜在优势，酶促合成方法受到了越来越多的关注。与化学法相比，酶促法的作用条件温和，对DNA的损伤较少，有助于准确性的提高，同时减少了副产物的产生，可实现更长Oligo的合成。然而，酶促法的发展缓慢，至今未能实现商业化。根据Jensen和Davis对DNA酶促从头合成发展的总结，末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）介导的酶促合成法是较好的选择，但还需要更进一步优化。TdT介导的DNA合成技术开发中首先需要解决单个dNTP添加后的终止效率及末端重新活化的问题。近期，Palluk等提出了一种解决方案，他们将 dNTP通过可光诱导剪切的连接子与TdT连接，所得dNTP-TdT复合物可在10—20s的时间完成DNA链的延伸，而且可以重复进行，实现特定DNA链的合成。该方法将为具有实际应用价值的酶促DNA合成法的开发打下基础。
2. 双链DNA/基因合成技术
DNA合成技术是合成基因组学，乃至现代分子生物学的根基,受当前合成技术的限制，双链DNA/目标基因组只能以短链Oligo的形式逐步拼接才能获得。PCR（聚合酶链式反应）或者酶切方法只限于获得自然界已有的DNA片段，而双链DNA/基因组的从头合成则需要通过Oligo的拼接获得，所以，如何提高Oligo合成的长度和效率、降低合成成本是后续进行大规模基因组合成的关键突破点。体外双链DNA的拼接根据原理区别，分为以下几种技术。
2.1 Gibson 组装
Gibson组装最早由Gibson等在2009年提出，原理如图2所示。该技术基于5′核酸外切酶、DNA 聚合酶及连接酶，利用DNA片段的两端同源序列（其长度通常为15−40bp），实现DNA组装。将这些DNA片段和3种酶的混合溶液孵育1h即可。5’外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；DNA聚合酶，用于修补由5’外切酶产生的缺口，在Gibson组装中用的是Phusion DNA聚合酶,当然，Taq DNA聚合酶也可以用；DNA连接酶，实现共价连接，形成完整的DNA分子。该方法的优势在于这3种酶都可以在同一个温度下发挥功能，可一步完成组装，组装后的质粒可直接用于转化感受态细胞，无需限制性内切酶，通常该方法可组装不超过6个片段。
2010 年，Gibson等科学家使用Gibson组装和酿酒酵母体内同源重组人工合成了1.08Mb的丝状支原体基因组并转入去核的山羊支原体，新移殖的细胞表现出了丝状支原体的性状。2016年，Hutchison 等人先用 PCR 合成一系列丝状支原体基因组片段，每个DNA片段长1.4 kb，然后每5个分成一组，再利用 Gibson 组装技术将5个一组的DNA片段连接成7 kb的单片段，最后组装成完整的基因组。作者只保留了必需基因，将1.08 Mb的基因组缩短到了含有473个基因的 531 kb。2017 年，Esvelt等人将Gibson组装技术与CRISPR/Cas9 技术结合构建了一个PAM质粒文库，用于评估鉴定来自不同物种的一系列不同的Cas9蛋白的活性。该方法在体外组装技术中应用广泛。
图2 基于5′核酸外切酶、DNA 聚合酶及连接酶的Gibson组装法
通过一步等温体外重组两个相邻的DNA片段(红色和蓝色，共用终端序列为黑色)，两个DNA片段共价连接成同一个DNA分子。T5外切酶去除双链DNA分子的5’端核苷酸，产生粘性末端，互补单链DNA退火结合在一起，Phusion DNA聚合酶填充缺口，Taq DNA连接酶密封缺口。T5外切酶是不耐热的，在50℃培养期间失活，所以不会与DNA聚合酶竞争DNA模板。
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