以丙肝病毒血清样本为例介绍如何提高RNA病毒核酸检测...

以丙肝病毒血清样本为例介绍如何提高RNA病毒核酸检测灵敏度

这段时间普通民众都是谈新冠病毒色变，无非印证了一句话「人们对不了解的事物才会感到恐惧」。为了减少我们的恐惧感，让我们来深入了解新闻发布会上不断提及的「新冠病毒核酸检测」吧。

首先分享中国疾控中心发布的检测新冠病毒的引物、探针序列：

推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框 1ab（open reading frame,ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针。

Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）：
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

这是个好消息，比较专业的同学一看就明白，根据上述疾控中心提供的资料合成引物探针后，再买个类似 Simgen 的 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Cat. No. 406100）预混 RT-PCR 试剂，就可以自制新冠病毒核酸检测试剂盒了。不过问题来了，核酸检测由两块内容组成：核酸提取+PCR 检测，仅有 RT-PCR 试剂是不够的，对于病毒 RNA 检测来说，病毒 RNA 提取反而是核酸检测的重头戏：因为样本中病毒 RNA 的数量通常很低（pg 级别）且容易降解，提取过程费时费力，以至于病毒 RNA 的回收效率直接就决定了检测的灵敏度，所以才会有一些不负责任的核酸诊断试剂厂家采用了逃避手法：只提供荧光 PCR 检测试剂，让用户自己去找核酸提取方法……好吧，假如你运气不好，需要自己选择病毒核酸提取方法，此文章应该挺有价值，我们以实验室最常见的 Trizol 试剂来进行病毒 RNA 的提取。

需要说明的一点是：我们实验室不是 P3 实验室，不敢玩非冠病毒，我们还是以同样是 RNA 病毒的丙肝病毒血清样本进行测试的，请大家谅解。

一、样本、试剂与仪器

丙肝病毒阳性血清，**** 医院检验科提供，经达安基因公司丙型肝炎病毒 (HCV) 核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）  产品检测病毒浓度为 10⁵ copies/ml。

用混合的人阴性血清将 10⁵ copies/ml 丙肝病毒阳性血清病毒稀释 10 倍获得 10⁴ copies/ml 血清；再用混合的人阴性血清将 10⁴ copies/ml 丙肝病毒阳性血清病毒稀释 10 倍获得 10³ copies/ml 血清。

Simgen 病毒核酸纯化试剂盒（Cat. No. 4002050），Simgen Trizol 试剂（Cat. No. 5301100），Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）
HCV 检测试剂盒：Acon 丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒 (PCR-荧光法)
PCR 仪：ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System
离心机：Thermo Biofuge pico

二、测试方法 

1、用 Simgen 病毒核酸纯化试剂盒、Trizol 加 Carrier RNA、Trizol 试剂分离纯化同一管 10³ copies/ml 血清样本中的病毒 RNA。（Trizol 提取方法：1 ml Trizol 试剂/1 ml Trizol 试剂含 3 µl Carrier RNA + 200 µl 血清混匀→+氯亻方混匀→离心取 750 µl 上清+600 µl 异丙醇→离心后用 75% 乙醇洗涤→50 µl RNase-free 水溶解，具体细节请自行脑补）

2、三种方法每次均从 200 µl 血清中分离纯化病毒 RNA，各做两管，RNA 最终洗脱/溶解体积为 50 µl。

三种病毒 RNA 提取方法获得的病毒 RNA 均取 10 µl 作为模板扩增，终反应体积为 40 µl，使用同一批次的 Acon 丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒 (PCR-荧光法) 进行扩增。（注：Acon 丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒 (PCR-荧光法)RT-PCR 实际循环数为 45 个循环，反应条件如下：42℃ 30 min,  95℃ 3 min,  [95℃ 10sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1 min(5 次循环)]，[95℃ 5sec, 60℃ 32sec (40 次循环)]）

三、实验结果

反应体系的阴性对照中加 10 µl 水作为模板，检测结果为阴性。
 

用不同方法提取的 10³ copies/ml 血清样本，检测结果如下图：
 

四、分析与讨论 

1. 从检测结果看，Trizol 试剂终究还是扩增起线了，只是 CT 值很大，趴下去了。Trizol 试剂加了 Carrier RNA 后起线正常。但是比病毒核酸纯化试剂盒大了差不多两个 CT 值。

2. Trizol 试剂在提取 10³ copies/ml 血清样本的时候，起线艰难，我们很担心提取 10² copies/ml 血清样本的时候还能不能起线，所以我建议那些宣传自己产品检测灵敏度高达 10² copies/ml 的厂家，是不是要限制一下配套的病毒核酸提取方法，否则有虚假宣传的嫌疑。现在新闻中也经常在争论新冠病毒核酸检测方法为什么有假阴性的问题，个人认为由于病毒 RNA 样本的特殊性，咽拭子样本的采样方式、保存条件，再到核酸提取，每个环节都有可能会影响到后续 PCR 检测的灵敏度，所以国家药监局在审批新冠病毒核酸检测试剂盒的时候应该优先通过包含病毒核酸抽提试剂的产品，这类企业提供的产品测试结果才会有比较高的稳定性。

3. Trizol 试剂加了 Carrier RNA 后，起线简直有了质的飞越，怎么解释？其实也简单：pg 级的病毒 RNA 沉淀效率太低了，但是在纯化体系中加了 µg 级的 Carrier RNA 后，沉淀病毒 RNA 效率完全就不是一个级别的了，我们一起看下照片：
 

大家都知道，RNA 比 DNA 要脆弱得多，很容易降解，当然 100℃ 不失活的强悍 RNA 酶是罪魁祸首，当 Carrier RNA 存在时，对于掩护病毒 RNA 不被 RNA 酶攻击，也是有重大意义的。Trizol 试剂提取的病毒 RNA 扩增曲线趴倒，不排除病毒 RNA 被降解，导致扩增困难的可能性。

4. 虽然 Trizol 试剂加了 Carrier RNA 后起线好了很多，但是和病毒核酸纯化试剂盒比较，还是大了两个 CT 值，也就是说病毒核酸纯化试剂盒提取病毒 RNA 的效率是 Trizol 试剂+Carrier RNA 的 4 倍，怎么解释呢？这要从 Trizol 试剂提取 RNA 的原理说起：Trizol 是硫氰酸胍+笨酚+乙酸的混合物，硫氰酸胍负责变性溶解蛋白（对于病毒颗粒最有价值的是溶解蛋白外壳）；笨酚负责萃取变性的蛋白质；乙酸负责维持低 pH 值，确保 DNA 维持不溶解的状态。首先在溶解病毒颗粒的环节，以胍盐溶解蛋白（病毒颗粒）的效率低于蛋白酶 K 消化蛋白（病毒颗粒），使得病毒 RNA 的释放效率低了一级，其次又在笨酚萃取的环节，由于刻意的调低 pH（目的是去掉 DNA，个人认为调高 pH 有助于病毒 RNA 的回收效率，毕竟宿主的 DNA 并不干扰病毒 RNA 的扩增），导致一部分病毒 RNA 又随着相间沉淀丢失了。两个不利因素的累积，是 Trizol 试剂提取病毒 RNA 效率低的主要原因。

其实 Trizol 试剂用作病毒 RNA 的提取，并非是 zui 好的选择，但优点是几乎所有的分子生物学实验室都能拿到。Trizol 试剂用作新冠病毒 RNA 检测时，灵敏度要达到 10² copies/ml 应该是有困难的，如果用 Trizol 试剂检测某些样本的结果和本次实验相似（趴倒的线），建议在 Trizol 试剂中补加 Carrier RNA，或者购买病毒核酸纯化试剂盒重测，以免漏检或者误判阳性样本。