细胞冻存复苏原则-慢冻快融操作与演示

培养细胞时为何要冻存一定数量的细胞？

有何意义？

细胞冻存的意义：

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态并将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其它意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。 

△  细胞培养过程

若直接冻存细胞，不加任何试剂时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，DMSO对与细胞的毒性根据浓度确定，甘油对细胞无毒性，两者分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

△  对比图

细胞冻存复苏遵循的原则是：慢冻快融

慢冻大家可参考之前的文章：细胞冻存的那些事儿~

今天我们来聊聊~  细胞复苏时需要注意的那些事儿~

细胞复苏的原则：

快速融化

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

复苏步骤

一. 实验前准备：

• 将水浴锅预热至37℃。

• 细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面。

• 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等。

二．取出冻存管：

• 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

• 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三．迅速解冻：

• 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动，使管中的液体迅速融化。

• 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四.平衡离心：

• 用架盘天平平衡后，放入离心机中1000r/min，离心5min。

五.制备细胞悬液：

• 吸弃上清液。

• 向离心管内加入10ml预热的培养液，吹打制成细胞悬液。

• 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。

六.细胞计数：

• 细胞浓度以5×10⁵/ml为宜。

七.培养细胞：

• 将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO₂的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。

八. 记录复苏日期：

细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出问题的部分，因此必须注意以下几点~

• 注意无菌操作。

• 取细胞的过程中可能会接触液氮，一定注意带好防冻手套，护目镜。

• 此项尤为重要，如果冻存管密封不严，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时，在水浴中摇晃，冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸，所以，一定要戴保护眼镜和手套，复苏过程中应盖上恒温水浴锅的盖。

• 应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。另外，细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。

• 细胞复苏过程中，升温的速率要大，把从液氮取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅。

• 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

• 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液，经验总结，培养基越少细胞越容易贴附。

• 复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

• 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果加培养基的太少，DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响。还有一个说法是1％。所以如果冻存液的浓度是10％DMSO，那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。    

   

初学者最易犯的错误：

• 水浴锅未预热或者未预热到37℃直接融化。

• 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

• 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

• 一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

 解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡，像水土不服一样。

结果分析：

判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。