如何在PCR检测过程中降低检测结果假阴性概率？

1. 什么是PCR技术？

PCR技术又称为聚合酶链式反应。是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
在新冠病毒检测中，核酸检测被定义为临床诊断的金标准，RT-PCR技术被反复提到，它是一种将RNA反转录与PCR相结合的技术。首先在反转录酶的作用下，将提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下不断扩增（变性-退火-延伸多个循环）合成目的片段并进行分析。
 

1. PCR用水

PCR技术目前多搭配试剂盒使用，也有用户自行制备反应体系，无论哪个过程都需要使用水。无论是近年来季节性爆发的甲流乙流，还是目前全球都在经历的新冠病毒，在检测过程中都涉及一个痛点，那就是如何尽可能提高核酸检测的准确性，减少假阴性结果出现的可能性。
我们首先分析一下假阴性结果出现的可能性，以新冠病毒核酸检测为例，假阴性的主要原因有：

• 病人病程：不同病程，患者体内病毒载量不同

• 采样部位：咽拭子，鼻咽拭子，痰液，肺泡灌洗液等不同采样部位病毒载量均不同

• 采样准确性：拭子质量，工作人员操作等

• 试剂盒的质量：引物设计以及水质控制

为了顺利将提取到的RNA反转录并实现DNA的成功扩增，必须抑制核糖核酸酶（RNases）的降解作用，如果试剂盒用水内含RNases，将极有可能导致假阴性结果的出现。
 

1. 去除RNases的主要方法

• 高压灭菌：即便是在180℃下高压灭菌4h之后，RNases仍保持某些活性，且某些特定细菌失活会释放更多的RNases

• DEPC法（二乙基焦碳酸酯处理法）：利用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理方法使化学酶失活是用来抑制水溶液中RNases活性的常见方法。然而，二乙基焦碳酸酯是一种可疑致癌物，处理须小心；同时该方法虽然能够使酶永久失活，却无法将其从水中去除，同时清除多余的DEPC过程中，会产生乙醇，二氧化碳等其他污染物。

• 超滤法：超滤是一种真正能够从水溶液中清除RNases的方法。默克Milli-Q选用内置在丙烯腈丁苯橡胶（ABS）外壳中的聚砜超过滤膜作为超滤柱的主要成分，在一定水流速一定浓度范围内，超滤具有充分的截留作用。超滤处理可有效取代DEPC处理方法生产无RNase水。