关于淘汰β脂蛋白测定
淘汰血清β脂蛋白测定的理由及替代项目
淘 汰 的 理 由
血清脂蛋白测定始于50年代，最早用纸电泳分析。当时的技术只能将脂蛋白分为α与β两条区带，不能将β与前β区带分开，而且也只能测α与β脂蛋白的相对含量。随着硫酸多糖类化合物(如肝素、硫酸葡聚糖)在分离制备脂蛋白研究中取得成功，1960年前后开始沿用这一原理设计出血清β脂蛋白(继续应用电泳法中的名称)简易比浊测定法。30年来国内通用肝素与β脂蛋白形成复合物，加入两价金属离子(Mn2+或Ca2+)产生混浊沉淀的方法，结果以沉淀物中脂质含量来表示，故又称β脂质测定。此法远比电泳法简单快速，适于分析成批标本，但仍不能区分β与前β脂蛋白。
此法的主要缺点有二：
1．浊度高低代表β与“前β”脂蛋白的总和(现在多称低密度与极低密度脂蛋白，LDL与VLDL)。LDL的组成主要是胆固醇，而VLDL的组成主要是甘油三酯(TG)。临床上需要知道血清总胆固醇(TC)与TG水平，而β脂蛋白试验不能满足这项要求。当时因直接测定TG尚无简单的方法，所以同时测定TC与β脂蛋白可以大致估计TG是否增高，但这毕竟相当粗糙。当前在心血管病危险因素估计中要求分别测定高密度脂蛋白(HDL)与LDL中的胆固醇(HDL—c与LDL—c)，更非β脂蛋白试验所能表达。
2．在测定方法上，因为LDL与VLDL脂质的相对含量以及它们各自的脂质组成均为可变，等量LDL与VLDL所产生的浊度也不一致，所以对β脂质的测定难于制定合适的标准品。各实验室自行制备标准物绘制标准曲线，测出结果没有可比性，根本谈不上“标准化”。有的实验室用硫酸钡人工浊度标准，当然也不可行。所以这项试验的浊度高低只是血脂高低的初步过筛试验而已。
可 替 代 的 试 验
近20年来脂蛋白生化、代谢与临床研究日益深入，测定计数发展迅速。对高脂蛋白症(包括高胆固醇血症及高甘油三脂血症)及特殊的脂蛋白异常情况的诊断，可以按照以下的程序进行检查。
1.血清(浆)外观检查
不要忽视这项肉眼观察所能提供的信息。血清混浊通常表示TG升高，将混浊血清装在小试管中，放置4℃冰箱过夜，如血清上浮奶油样层而下部变清者，产示有乳糜微粒(CM)增加(故又称CM试验)，如不分层而保持原先的混浊者表示为VLDL增多，有奶油样顶层而下部依旧混浊者表示CM与VLDL都增多。高胆固醇血症而无高TG者血清不出现混浊。
2．TC测定
这是脂类分析中最常用的试验。TC高低通常反映LDL-C的高低，但也在一定程度上受HDL-C水平的影响。
3．TG测定
是高甘油三酯血症的诊断指标。除了餐后外，空腹血中出现CM是少见的，所以空腹血中TG升高代表VLDL增多。
4．HDL-C测定
HDL有促进胆固醇逆向转运的功能，可能有拮抗动脉壁脂质沉积的作用。HDL-C降低是心、脑血管病的危险因素之一，目前大医院中已将HDL-C测定作为常规检验，也用於流行病学调查。
5．LDL-C测定
国内多用Friedlewald公式计算LDL-C数值，此公式为，
LDL-C＝TC—HDL—C—BLDL-C
原式采用旧单位(mg／d”，BLDL-C以TG／5代入，意即VLDL—C与血清TG之比为1：5。在病理状态下，此比例有较大变动，一般认为TG高于400mg／d1时计算结果不准确。此外只有TC、TG、HDL-C三项测定都准确可靠，才能计算得 LDL-C的近似值。现在已经有LDL-C直接测定方法，并有试剂盒提供，但在TG过高时，对测定结果也有一定影响。
卫生部1991年第18号文件中指定的β脂蛋白后的可替代项目即上述2、3、4三项。临床及实验室工作者应该知道β脂蛋白测定只是过去受技术条件限制所采用的半定量实验，不能具体反映TC、TG及脂羞白谱的变动情况，基层医疗单位也应该创造条件采用新技术，淘汰过时的技术，以提高防治工作水平。
血清总胆固醇测定方法
血清胆固醇(CHOL)测定方法种类繁多，化学方法大都用有机溶剂提取血清中的CHOL，用特殊试剂显色，然后比色测定。主要显色反应有Liebermann—Burchard(L-B)反应及高铁—硫酸反应等两类。这些方法须用腐蚀性的浓酸试剂，特异性差，干扰因素多，准确测定有赖于从血清中提取胆固醇，并对抽提液进行纯化。因此操作步骤多，不适于常规应用。美国疾病控制中心(CDC)脂类测定标准化实验室所审定的ALBK法，由于抽提液中基本上不存在L-B反应的干扰物，结果准确，为目前国际上通用的参考方法。此法虽然不很复杂，但也不易准确掌握。现在还有少数实验室应用L—B试剂直接显色法、邻苯二甲醛法等，准确性差，已在淘汰之列。
在常规工作中现在已普遍应用酶法。此法特异，灵敏，精密，用单一试剂直接测定，既便于手工操作，也适用於。自动分析仪测大批标本；既可作终点法，也可作速率法测定。酶法都采用胆固醇酯酶(CEH)水解胆固醇酯(cE)，同时以胆固醇氧化酶(CHOD)将胆固醇氧化成胆甾烯酮并产生H202终点物的测定则有几种不同的方法。目前普遍应用依赖于H202的显色系统，即Trinder指示反应，试剂包括过氧化物酶(POD)、4—氨基安替比林(4—AAP)和酚(三者简称PAP)。
总胆固醇(TC)铡定要求做到标准化，与国际标准取得统一。化学测定的胆固醇标准液应以美国NIST(原NBS)的SRM911b为准，其纯度为99.8±0.1％。国内应制出相应的胆固醇纯品。酶法中常用定值血清作标准，规定用参考方法(ALBK法)定值，定值时须用相当于SRM91Jb的胆固醇纯品配制标准溶液。
以下介绍通用的酶法(CHOD-PAP法)。
原理
血清中的CE用CEH水解，游离胆固醇被CHOD氧化，所产生的H202用Trinder反应显色：
CEH
CE+H2O--------→胆固醇+脂肪酸
CHOD
胆固醇+O2--------→△4△甾烯酮+H2O2
POD
2H2O2+4AAP+酚--------→醌亚胺染料+4H2O
红色醌亚胺的最大吸收在波长500nm，吸光度(A)与血清TC量成正比。
(二)试剂
1．酶试剂
组成因不同商品而异，为干粉或冻干品。成分举例如下。
磷酸盐缓冲液，pH7.7 0.3mol／L
CEH(假单胞菌) ≥800u／I
CHOD(诺卡氏菌) ≥400u／L
辣根POD ≥5000u／L
胆酸钠 3mmol／L
4—AAP 0.5mmoi／l
酚 3.5mmol／L
表面活性剂(TritonX—100)与稳定剂适量? 此试剂在4℃至少稳定半年。复溶后在4℃稳定二周。
2．参考标准
以ALBK法定值的混合血清，TC浓度在5．2mmol／L(200mg／d1)左右。冻干品可在4℃存放一年，临用前以水复溶。
(三)测定操作
标本为及时分离的空腹血清：肝素或EDTA抗凝血浆，放置室温中应于当天测定，存放4℃冰箱中可在5天内测定。
终点法：标本管与标准管中分别加入标本与定值血清各10ul，酶试剂1.00ml，混匀后在37℃放置5分钟，或20—25℃、10分钟后用光度计比色，以酶试剂为空白，波长500nm，呈色稳定至少1小时。
计算： 标本管A
血清TC(mmol／L)＝---------------×定值血清TC(mmol／L)
标本管B
本法线性范围：0—13mmol／L(0—500mg／L)
参考值：
人群TC水平因生活条件而异，随年龄增长而上升。中青年男子略高於女子，老年女子高于男子。中、老年人合适水平为<5.2mmol／L(<200mg／dl)，5.2—6.5mmol／L(200—250mg／d1)为临界值(或轻度偏高)，>6.5mmol／L(>250mg／d1)为高胆固醇血症(危险水平)，>7．8mmol／L(>300mg／d1)可视为严重的高胆固醇血症。
(四)附注
1．试剂甲两种酶(CEH和CHOD)的质量十分重要。CEH必须能有效地水解各种脂肪酸(包括花生四烯酸)的胆固醇酯，CHOD氧化胆固醇完全。选用试剂盒时可以测试对血清标本胆固醇的反应速度。好的试剂一般能在5分钟(有的只要1—2分钟)内；反应达到终点，反应不能在10分钟内完成的试剂不宜采用。其原因可能是原酶质量不好，或酶用量太少。后者可便TC高浓度时的测定值偏低。按本文所述试剂配方，血清标本与酶试剂用量的适当比例为1：100，此时测定范围上界达13mmol／L(500mg／dl)。过高地提高血清比例，会使测定上限降低。如果标本中TC浓度超过13 mmol／L，可用生理盐水稀释后重新测定
2．指示反应选择最常用的Trinder法，主要优点是所生成的红色复合物在低POD活力下也能形成，溶解度高，对自氧化不敏感，线性范围宽，颜色稳定。此反应中可以用酚或苯胺的衍生物代替酚·；也可以用高灵敏度的2羟—3．5二氯苯磺酸：2、4、6三溴一3羟苯甲酸等为色原。但在临床应用中只要能兼顾TC与HDL-C测定，灵敏度适当的试剂即可。
3．血清中的胆固醇与纯胆固醇溶液(醇溶液或有助溶剂的水溶液)在酶作用下的反应速度不一致，原因不仅在于前者CE占70％，而后者为游离胆田醇，而且还有作用时的基质不同，不同酶制品对CE的水解程度不同，血清中干扰物的存在等因素。所以现在多主张用定值血清为参考标准。如果采用准确定值的血清，用任何合格的商品试剂都可测出基本一致的结果。为了使TC测定符合国际标准化，定值血清的准确性最好与CDC参考血清核对。
4．干扰因素
血清维生素c 30mg／L、胆红素0.1g/L时对Trimder反应不会有明显干扰，过高可使结果偏低。血红蛋白可能引起正干扰。血清中其他固醇类物质含量甚微，不引起明显干扰
5．本法精密度好，在仪器稳定及操作熟练的情况下，批内CV<1％，批间CV<2％。
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