[摘要]
目的:
研究氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶对948株真菌的体外抗菌活性。方法:真菌收集自2004年1月至2005年4月于北京协和医院住院患者提供的标本。分别采用酵母菌纸片扩散法敏感试验,Mueller-Hinton琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝,其他操作类似于美国国家临床实验室标准委员会M2-A6细菌药敏试验法;以及ATB? FUNGUS 2敏感试验两种方法。结果:白念珠菌最常见,占59%,其次为热带念珠菌占15%,光滑念珠菌占13%,克柔念珠菌占2%,烟曲霉占2%和近平滑念珠菌占2%、四种药物对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较高的抗菌活性。结论:抗真菌药的类型不同,对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异,伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌:白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性。
[关键词]
抗真菌药;微生物敏感试验;真菌
真菌感染已成为白血病,淋巴瘤,免疫抑制,长期使用广谱抗生素,中心静脉插管,中性粒细胞减少,? 烧伤,低体重的早产儿,高APACHEⅡ积分,血液透析,骨髓或器官移植,胃肠道手术和机械通气等特殊人群的严重感染性疾病。过去临床对真菌感染的经验治疗主要选择三唑类利两性霉素B,但近10年真菌的种类发生了明显的变化,有高达77%的酵母菌菌血症是非白念珠菌引起的,它们对抗真菌药可以产生耐药性,酵母菌感染的治疗面临新的挑战[1,2],因此,对威胁生命的真菌感染的患者,进行真菌药敏试验非常重要。为调查真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性,我们采用纸片扩散法和ATB FUNGUS 2两种方法测试948株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性。
材料与方法
一、菌株来源
从2004年1月至2005年4月北京协和医院患者临床血液、尿液、胸腹水、脑脊液和下呼吸道标本中分离出可能致病的948株真菌。见表1、2。采用ChromG A显色培养基鉴定白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌,其他念珠菌采用VITEK YBC卡鉴定到种的水平。
表1? 948株17种真菌所占百分比
菌株 | 株数 | (%) |
白念珠菌 | 573 | 59 |
热带念珠菌 | 149 | 15 |
光滑念珠菌 | 126 | 13 |
克柔念珠菌 | 22 | 2 |
烟曲霉 | 22 | 2 |
近平滑念珠菌 | 21 | 2 |
葡萄牙念珠菌 | 11 | 1 |
黄曲霉 | 7 | 1 |
新型隐球菌 | 5 | 1 |
青霉属 | 4 | 0 |
土曲霉 | 2 | 0 |
季也蒙念珠菌 | 1 | 0 |
念珠菌属 | 1 | 0 |
无名念珠菌 | 1 | 0 |
镰刀霉 | 1 | 0 |
头状地霉 | 1 | 0 |
酿酒酵母 | 1 | 0 |
表2? 6种真菌在2004年-2005年的分离情况
真菌名 | 2004年1-12月 | 2005年1-4月 |
白念株菌 | 468 | 104 |
热带念珠菌 | 133 | 15 |
光滑念珠菌 | 95 | 28 |
克柔念珠菌 | 21 | 1 |
近平滑念珠菌 | 13 | 9 |
烟曲霉 | 20 | 2 |
二、抗真菌药
氟康唑,25μg/片,未开封的纸片-20℃保存,开封后冰箱保存4周。ATB FUNGUS 2试条,含有伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶和两性霉素B。
三、真菌药敏试验法
1.纸片扩散法敏感试验
采用2003年美国国家临床试验室标准委员会(NCCLS)建议的酵母菌纸片扩散法敏感试验指南,在Mueller-Hinton(MH)琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝[3],在1L MH琼脂中,加入0.1ml美蓝(methyleneblue,Merck BP 1973产品)贮存液(0.1g美蓝加20ml无菌水即为美蓝贮存液)和20g葡萄糖。高压15min,121℃灭菌,水浴至55℃倾入4mm厚平皿备用。敏感试验其他操作步骤,与标准的细菌纸片法药敏试验相似,酵母菌悬液用无菌盐水比浊至0.5号麦氏管浊度,酵母菌量约为1×106~5×106/ml
2.ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验
ATB FUNGUS 2试条包括16对凹形杯。第一对不含任何抗真菌剂,用作阳性生长对照。另外的15对包含不同浓度的4种抗真菌剂,用于测定最小抑菌浓度(MIC)。将准备好的待测酵母菌的悬浮液转移到培养基中,并接种到试条上。孵肓后,通过肉眼判读凹形杯中液体的生长情况,获得MIC。试验条采用手工接种用ATB电子移液管混匀ATB F2培养基,避免产生气泡,使用ATB电子移液管在每个凹形杯中加入135μl的ATB F2培养基(大约3×104酵母菌/毫升或4×104酵母菌/凹形杯)。将一个盖子放在试条上,把试条放入一个密闭容器或是—个装有吸潮纸的GENbox型广口瓶里,在有氧条件下35℃(±2℃)的环境中,念珠菌属要培养24小时(±2小时),新型隐球菌要培养48小时(±6小时)。对念珠菌属来说,如果在生长质控指示的凹形杯中生长不充分,24小时培养后,很难或是不可能读出试条的MIC,这时要在同样的环境下再培养24小时。
四、药敏指控
采用白念珠菌ATCC90028氟康唑可接受的抑菌环直径范围为28-39mm
五、结果判读
1.纸片扩散法敏感试验
读取抑菌环直径近似到mm,在大约80%抑制区判读为测量边界。在抑菌圈边缘或内部的极微小菌落(<20=可忽略不计,采用BIOMIC电子自动阅读系统读取抑菌环直径(mm),并自动换算出相应的最低抑菌浓度(MIC)值(mg/L)[4]。氟康唑和5-氟胞嘧啶敏感性的解释标准见表3。
表3 氟康唑和5-氟胞嘧啶纸片扩散法的抑菌环直径和相应MIC的解释标准
抗真菌药 | 氟康唑 | 氟康唑 | 5-氟胞嘧啶 |
抑菌圈直径/mm | MIC(mg.l/l) | MIC(mg.l/l) | |
敏感(S) | ≥19 | ≤8 | ≤8 |
剂量依赖性敏感(SDD) | 15-18 | 16-32 | 16-32 |
耐药(R) | ≤14 | ≥64 | ≥64 |
2.ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验
通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况。为方便肉眼判读,把试条放在黑暗的背景下。对于每一个抗真菌制剂,从低浓度开始,与生长对照杯状凹比较,记录每一个杯状凹的生长得分见表4。对于两性霉素B,最小抑菌浓度(MIC)应该判断为省长完全受抑制的测试杯的浓度(即得分为“0”的测试杯)在杯状凹外围存在一个(或几个)散在的菌落或生长迹象,应记录为“1”分。对于氟康唑,伊曲康唑和5—氟胞嘧啶,鉴定可能存在拖尾生长,最小抑菌浓度(MIC)对应的测试杯得分可以是“2”,“1”,或是“0”分。且在杯状凹外围的生长迹象应记录为“0”或“1”分。[5]
表4.凹形杯的生长与得分
定义 | 得分 |
和生长对照完全一样 | 4 |
比生长对照有轻微减少 | 3 |
比生长对照孔明显减少 | 2 |
非常微弱的生长 | 1 |
没有生长 | 0 |
六、数据分析
文中所得表格采用WHO耐药监测组提供的软件WHONET5.3分析所得。
结? 果
909株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和5—氟胞嘧啶的药敏试验结果见表5。
菌株数<10株的菌种未参加分析,,表5显示采用纸片扩散法敏感试验结果:氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的敏感性为23.8%~100%。采用ATB FUNGUS 2敏感性检测结果:其中热带念珠菌的MIC50为0.125~l,MIC90为0.5~1.6。
四种药物对白念珠菌、热带念珠菌有较高的抗菌活性。氟康唑对光滑念珠菌有较低的抗菌活性,其MIC50和MIC90范围明显高于两性霉素B和伊曲康唑,两性霉素B和伊曲康唑比氟康唑对这2种念珠菌有较高的抗菌活性。且伊曲康唑和两性霉素B对烟曲霉有较高的体外抗菌活性。
表5? 6种真菌对抗真菌药物的体外敏感性
真菌名 | 株数 | 抗真菌药 | 耐药% | 中介% | 敏感% | MIC50 | MIC90 | MIC平均值 | MIC范围 |
白念株菌 | 468 | 氟康唑* | 0 | 1.1 | 98.9 | ||||
104 | 氟康唑 | 7.7 | 0 | 92.3 | 0.5 | 4 | 0.702 | 0.25-256 | |
104 | 伊曲康唑 | 0.125 | 0.5 | 0.195 | 0.016-8 | ||||
103 | 两性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.497 | 0.25-0.5 | ||||
104 | 5-氟胞嘧啶 | 1.9 | 0 | 97.1 | 0.5 | 0.5 | 0.581 | 0.19-128 | |
热带念珠菌 | 133 | 氟康唑* | 0.8 | 0.8 | 98.5 | ||||
15 | 氟康唑 | 6.7 | 6.7 | 86.7 | 1 | 16 | 1.382 | 0.25-128 | |
15 | 伊曲康唑 | 0.125 | 1 | 0.239 | 0.125-4 | ||||
15 | 两性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.477 | 0.25-0.5 | ||||
15 | 5-氟胞嘧啶 | 0 | 0 | 100 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5-0.5 | |
光滑念珠菌 | 95 | 氟康唑* | 12.6 | 3.2 | 84.2 | ||||
27 | 氟康唑 | 7.4 | 18.5 | 74.1 | 4 | 32 | 4.548 | 0.25-512 | |
26 | 伊曲康唑 | 0.5 | 4 | 0.5 | 0.125-8 | ||||
26 | 两性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.462 | 0.016-1 | ||||
28 | 5-氟胞嘧啶 | 0 | 3.6 | 96.4 | 0.5 | 0.5 | 0.443 | 0.032-32 | |
克柔念珠菌 | 21 | 氟康唑* | 57.1 | 19 | 23.8 | ||||
1 | 氟康唑 | 64 | 64 | 64 | 64-64 | ||||
1 | 伊曲康唑 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5-0.5 | ||||
1 | 两性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5-0.5 | ||||
1 | 5-氟胞嘧啶 | 2 | 2 | 2 | 2-2 | ||||
近平滑念株菌 | 13 | 氟康唑* | 0 | 0 | 100 | ||||
8 | 氟康唑 | 0.5 | 8 | 0.771 | 0.5-8 | ||||
9 | 伊曲康唑 | 0.125 | 0.5 | 0.135 | 0.062-0.5 | ||||
9 | 两性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.429 | 0.125-0.5 | ||||
9 | 5-氟胞嘧啶 | 0.5 | 0.5 | 0.355 | 0.023-0.5 | ||||
烟曲霉 | 17 | 伊曲康唑 | 0.5 | 1.5 | 0.588 | 0.19-2 | |||
18 | 两性霉素B | 0.25 | 6 | 0.379 | 0.006-64 | ||||
15 | 5-氟胞嘧啶 | 1 | 64 | 2.014 | 0.032-64 |
讨论
本研究提示:氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠闰有较高的抗菌活性。文献报道真菌血流感染自1980年的5.4%增加至1990年的9.9%,念珠菌菌血症的病死率为38%[6]。在美国流行病学研究发现,白念珠菌过去是最常见的念珠菌病的病原菌,但近来检测结果提示白念珠菌仅为55%,非白念珠菌为45%[6]对烟曲霉而言,伊曲康唑比两性霉素B有较低的MIC值,伊曲康唑对烟曲霉有较高的抗菌活性。对非白念珠菌中的光滑念珠菌和克柔念珠菌,伊曲康唑对光滑念珠菌的抗菌活性低于两性霉素B,氟康唑对这两种念珠菌显示出较高的耐药性,尤其对克柔念珠菌。本研究结果表明:抗真菌药的类型不同,对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异,伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌:门念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性;伊曲康唑、两性霉素B对烟曲霉有较高的抗菌活性;氟康唑对克柔念珠菌和部分光滑念珠菌表现出较高的耐药性,但伊曲康唑试验株数较少,无法评估。
参考文献
1.徐英春,王澎,陈民钧.辉瑞公司全球多中心酵母菌敏感性监测结果[J].中国抗感染化疗杂志,2003,3(3):187—190
2.Wenzel R, Brewer TF, Butzler JP, et al. fungi, A guide to infection control in the hospital(2nd Edition),international society for infection diseases[M].Boston,MA.USA,BC Decker Inc Hamilton.London,2002,157-159
3.National Committee for Clinical Laboratory Standards.Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts;proposed guideline[S].NCCLS M44-P,2003,123:6
4.Berke I,Tierno PM Jr. Comparison of efficacy and costeffectiveness of BIOMIC video and Vitek antimicrobial susceptibility test systems for use in the clinical microbiology laboratory [J].J Clinical Microbiology,1996,34:1980-1984
5.徐英春,王澎,原英等.氟康唑和伏立康唑对酵母菌抗菌活性的研究[J].中国抗感染化疗杂志 2003,3(5):277-279
6.Rangel-Frausto MS,Wiblin T, Blumberg HM,et al.National Epidemiology of Mycoses Survey.Variations in rates of Candida Bloodstream Infections due to candida species in Seven surgical ICUs and six Neonatal ICUs[J].Clin Infect Dis 1999,29:253-258