HbA1c: 标准化以及临床实验室检测 （二）

      HbA1c以及Hb变异体的病理学
      糖化作用是一种非酶参与的糖分子与蛋白质氨基的结合反应。当葡萄糖与β链N-端缬氨酸中的一条或两条结合形成希夫碱时，血红蛋白（Hb）的糖化就发生了。这一快速却不稳定的过程随后会缓慢形成一个不可逆的氨基酮（阿马多尔重排）。这一稳定的氨基酮形成将影响红细胞的生存期。糖化血红蛋白（GHb），有时也被称之为血红蛋白Alc（HbA1c）、糖血红蛋白、HbA1或Alc，都是用来描述Hb与葡萄糖非酶结合缓慢形成的一系列稳定的次要Hb成分。为了消除关于GHb以及临床实验室测试之间的术语混乱，美国临床生化学会（NACB）的指南建议使用“Alc测试”作为有关糖尿病诊断以及管理的实验分析术语。HbA1，包括HbA1a、HbA1b以及HbA1c，其名字都是因为它们的快速洗脱性质可以通过阳离子交换色谱法定量测试而得来的。HbA1a以及HbA1b仅占HbA1的大约20%，HbA1c才是HbA1最主要成分，占剩余的80%左右。血红蛋白的糖化作用符合质量作用定律，因此糖化作用的程度可以通过测试血红蛋白的浓度以及血糖升高的持续时间以及程度来确定。在GHb中，HbA1c可以反映出糖化情况，所以它是GHb中被研究的最多的一项。

      HbA1c值不仅仅受血糖浓度的影响，同时也与红细胞的生存有关。HbA1c的合成速率与超过平均120天生命周期的红细胞糖化量成函数关系（图2）。这一关系为临床提供了一项有用的指数，即过去120天内的平均血糖指数。一个在过去3个月内血糖浓度正常的人（60mg/dL-100mg/dL，3.5mmol/L-5.5mmol/L）其HbA1c值应该＜6.5。DCCT中的几项研究证实了这一发现，这也促使ADA建立了现行的HbA1c与平均血糖浓度的关系标准（表2）。然而考虑到病人的红细胞生存期可能会有变化（缩短或延长），这就使得糖尿病管理指南中所使用的这一关系可能就不那么有效。举例来说，当血细胞生存期缩短时可导致衰老的红细胞数目不成比例，此时与平均血糖浓度相比就可能得出HbA1c值的假性偏高。这种情况可能在缺乏铁、维生素B12以及叶酸的病人身上出现。与之相反的是过快的红细胞周转会导致新生红细胞的比例过大而产生假性低HbA1c值。这一情况多见于溶血病人和那些治疗铁、维生素B12以及叶酸缺乏的病人，或者是那些带有诸如HbS或HbC等Hb变异体的病人身上。现在还没有建立起用于HbA1c与变化的RBC生存期之间关系的指导标准。此外，在一些情况下当Hb分子出现突变时（Hb变异体），一些方法学可能会产生明显的HbA1c值的偏差。这一偏差已被证实取决于所使用的方法这和特定的Hb变异。目前已确定的Hb变异体超过了975个。除了对RBC生存期的影响，这些变异体也可能会干扰到HbA1c的分析。根据所采用的特定方法和变异体的存在，HbA1c值有可能会出现假性升高或降低。比如，如果不能有效地解决Hb变异体的问题，就将导致离子交换HbA1c测试方法出现严重的错误结果。更为重要的是，如果Hb变异体改变了RBC的生存期，其影响将会更大。不论HbA1c检测的标准化工作取得多大进展，Hb变异体的存在都会长期成为影响采用HbA1c值评估病人平均血糖浓度的准确性的一个巨大障碍。

      HbA1c的临床实验室分析
      目前用来检测HbA1c的商品化方法多达30种以上。其中最常用的两种测试原理是基于HbA1c的电荷差（离子交换层析法和电泳法）和结构差异（硼酸基亲和层析法和免疫法）。按照1995年CAP调查，54%的实验室报道的HbA1c值都是采用亲和层析法。有趣的是，2007年CAP的调查却给出了一个彻底的改变，大部分实验室（超过97%）都开始使用免疫法和离子交换法（图3），这些方法的确是更适合于常规临床实验室使用。这一巨大的改变在另一方面说明了HbA1c测试正越来越多地作为平均血糖值控制评估指示被使用着。DCCT制定的糖尿病管理的指导方针强调了HbA1c值的重要性，同时也强化了那些非经典方法的操作特点，尤其是不为人注意的诸如由HbS和HbC等常见Hb变异体所引起的错误的HbA1c测试结果。

     按照2007年的CAP调查，离子交换层析法，也就是通过电荷差异将Hb类物质分离的一种方法，占了HbA1c检测方法的大约32%以上。这其中最为典型的是阳离子交换层析法。它是根据电荷的不同，用离子浓度强的缓冲液在不同的时间将Hb族从阳离子交换柱中洗脱下来。洗脱后检测Hb的浓度，通过计算每个峰值下的面积并根据浓度来定量HbA1c。通常，Hb分子的变化或突变会导致其与野生型Hb族的电荷不同，这有可能会在采用阳离子交换层析法时改变这类Hb的正常洗脱时间。表3显示了在一个己知样品中用于测定HbA1c值的方程式，并说明了当Hb变异体不能从HbA或HbA1c中分离出来时Hb洗脱时间的变化对HbA1c值的影响。虽然在一些离子交换层析法中改变流动相的离子强度可以减少一些常见的Hb变异体（HbS和HbC）的共同洗脱水平，但仍然建议临床医生考虑采用其他方法来取代HbA1c作为平均血糖浓度评估的手段，例如糖化白蛋白或者果糖胺，从而避免在为病人解释其HbA1c值时引起困扰。

      表3 采用离子交换层析法，Hb变异体对HbA1c值计算的影响
 

      硼酸基亲和层析法是另一项在临床实验室一直使用的HbA1c测试方法。这一方法可以区分糖基化血红蛋白族的结构差异，并被证实在所有的商用方法中是受Hb变异体和衍生物存在干扰影响最小的方法。该方法可被用来测试总GHb、HbA1c以及在Hbα和β链赖氨酸以及N-端缬氨酸上形成的氨基酮结构。这一测试原理是将总GHb固定于包含有交联琼脂糖或玻璃珠的m-氨基苯硼酸的柱子中。通过山梨醇分离复合物，并将所有的GHb洗脱出来。接下来可以用分光光度仪或通过荧光淬火法来检测总GHb和HbA1c。有报道称一种商品化检测方法不受Hb变异体或衍生物的干扰。然而其它的商品化方法在测试有HbAC和HbCC变异的样品时对总GHb值仍存在影响。2007年CAP调查显示，采用硼酸基亲和层析法监测GHb值要比采用其它方法多2%。

      据2007年CAP调查，免疫比浊法是目前用来测试HbA1c值最常用的方法（65%）。该方法采用的是抗体介导的乳胶凝集抑制原理来定量测定HbA1c。其使用的单克隆或多克隆抗体可以识别血红蛋白β-链上N末端糖基化的前4-10个氨基酸，但这些抗体不能识别可逆的希夫碱或其它的GHb族。不幸的是，当采用能识别Hb β链上第6位氨基酸的抗体时，最容易受到的干扰就是来自最常碰到的Hb突变体HbS（Hb β链氨基酸6，Glu＞Val）和HbC（Hb β链氨基酸6，Glu＞Lys）。其它一些已经被证明可以导致HbA1c值降低的Hb还包括HbF、Hb Graz以及Hb Raleigh。任何能导致Hb β链N末端前4-10个氨基酸改变的变异体都会在使用这些抗体进行测试时带来错误结果。然而事实上有些方法并不受这些常见Hb变异体的影响。在www.ngsp.org 网站上我们可以找到一份列举了11种常见免疫比浊法测试HbA1c的资料，以及在常见Hb变异体存在的情况下有关测试精确度的研究清单。为了减少Hb变异体给免疫比浊法测试HbA1c所带来的错误，越来越多的商家的产品中所采用的单抗只针对Hb β链第2位氨基酸的糖化形式。虽然免疫比浊法给临床实验室带来低成本和自动化的优势，但这种方法显而易见的问题是可能无法区别病人体内所有的Hb变异体。离子交换层析法以及硼酸基亲和层析法有时还能检测出Hb变异体，相比较则言，免疫比浊的“封闭管”结构使用户不能从Hb洗脱产物或样本中区别出伪造的变异体来。基于这一原因，在Hb变异体发生率较高的人群中，选择免疫比浊法时应该慎之又慎。

      推荐在做HbA1c测试时，考虑或需要评估有Hb变异体存在的指标为HbA1c＞15%或更多。另外，如果你所在实验室所用的方法受到Hb变异体的干扰时，建议使用其它的方法。最后，如果Hb变异体会改变RBC的生存期，那么应该考虑用诸如糖化白蛋白或果糖胺等替代品作为平均血糖浓度的评估手段。可惜的是，还没有像研究HbA1c这样的大型临床研究对糖化白蛋白和果糖胺值在慢性糖尿病并发症风险评估中的价值进行过调查。

      从数据上看，离子交换层析法和免疫比浊法是最常用的测试HbAlc的方法。虽然这些方法中的大部分都不受常见杂合子变异体的影响，但现在却没有一个明确的指导标准供临床医生和糖尿病患者参考。特别是对于一些没有HbA存在的糖尿病患者，诸如纯合子HbS,HbC或HbSC疾病，由于受到RBC的生存期的影响以及体内氨基末端β链的糖化，因而所有检测HbA1c方法作为平均血糖浓度的评估都是不合适的。这也是出现文章开头所描述的患者情况的原因。该患者除了患有糖尿病外还有HbC疾病。HbC变异体导致病人RBC的生存期缩短，并最终引起HbA1c值的降低。

      总结与结论
      本文主要阐述了糖尿病与HbA1c之间的关联、HbA1c作为长期平均血糖浓度监控指标的标准化工作和HbA1c的病理学以及当前临床实验室所采用的测试方法的缺陷。包括DCCT以及UKPDS在内的长期研究表明，平均血糖浓度（HbA1c）和糖尿病并发症的严重性有关，因此告知临床医生和糖尿病患者可通过测试HbA1c值来减少问题的发生。这进一步加快了所有进行HbA1c测试的临床实验室的标准化工作的进行。通过他们的努力，HGSP和IFCC已经为达到这一目标铺平了道路。

      尽管取得了一些进展，但由于Hb变异体的存在，许多现行的HbA1c测试方法还是受到了特别的限制。在一些Hb变异体的高发区，必须要慎重地选择HbA1c测试方法，以避免一些不必要的错误。在这些可能导致HbA1c不准确的人群中建议使用其它的替代方法（如：糖化白蛋白和果糖胺）对平均血糖测试进行监控。但目前还没有对这些人群和这些方法进行过系统的研究，故尚无可供临床医生和患者参考的指南。所以，临床医生在采用糖化白蛋白和果糖胺对长期平均血糖浓度进行评估时应该非常的谨慎。首先，糖化白蛋白和果糖胺只能评估过去2周内的糖化情况，而不是像HbA1c可以评估过去2-3个月的情况。另外，糖化白蛋白与果糖胺与糖尿病长期并发症发展进程之间的关联不像HbA1c那样强。

      参考文献（略）
      作者简介：Ross J. Molinaro,PhD,MT（ASCP），美国亚特兰大Emory大学医学院病理和检验医学系临床生化专家。