肠球菌的耐药特点及药敏试验方法

肠球菌是临床较常见的一类。据近些年的报道，肠球菌已成为医院感染中重要的病原菌，危害性越来越大。肠球菌往往对抗生素耐药或高度耐药，能否准确检出耐药菌株对抗感染治疗的成败十分重要。针对肠球菌的药敏试验方法，国外进行了相当多的研究，确定了一整套科学的方案。以下将有关问题作简要介绍。

　　一、临床常见的肠球菌

　　肠球菌原属链球菌属，自1984年独立新菌属以来，至今起码有19个菌种^［1，2］。1990年Ruoff等^［3］研究了临床标本中肠球菌的分布特点，分离到8个菌种，粪肠球菌和屎肠球菌占绝大多数，见表1。还有鸟肠球菌(0.3%)、坚肠球菌(0.3%)、母鸡肠球菌(1%)、酪黄肠球菌(1%)、空肠肠球菌(0.3%)和棉子糖肠球菌(0.3%)。1992年马俊春^［4］也做了相似报道。

表1　肠球菌在临床标本中的分离率(%)

　　各种肠球菌的分布状态因抗生素的使用发生变化。以万古霉素作为治疗感染的首选药物，造成万古霉素耐药菌种的增加。Boyle等^［5］观察到1990～1992年3年间屎肠球菌逐年递增，分离率分别为10.9%(1990年)、26.0%(1991年)、34.0%(1992年)。

　　二、肠球菌的耐药特点

　　肠球菌的耐药特点主要表现在青霉素、氨基糖甙类药和万古霉素^［6］。对青霉素敏感的菌株最低抑菌浓度(MIC)＜8μg/ml， 如MIC＞16 μg/ml，定义为耐药。多数菌株对青霉素耐药系产生了β-内酰胺酶。有部分不产生β-内酰胺酶，但MIC＞128　μg/ml，是由于产生过量的慢反应青霉素结合蛋白(PRS)。对这种高度耐药的菌株， 青霉素与氨基糖类联合用药也无作用^［7］。

　　一些肠球菌株对氨基糖甙类药物表现高度耐药，MIC＞2 000μg/ml。这一现象称氨基糖甙类高水平耐药(HLAR)。HLAR是因细菌产生了多种氨基糖类修饰酶(AME)。一种AME可起到对多种氨基糖类药物耐药的作用。一株细菌可以同时产生几种AME，表现出多重耐药。HLAR菌株仅对万古霉素敏感。屎肠球菌的AME基因位于染色质上；其他肠球菌的则位于质粒上，并且能够在不同菌种间传播耐药性。

　　肠球菌对万古霉素耐药初见于1988年，已确认有3种程度不同的耐药，分别由Van A、Van B和Van C3种耐药基因决定。Van A位于染色质上，Van B和 Van C由质粒携带。Van A和Van B菌株的耐药程度高。Van C为低水平耐药。各种肠球菌的万古霉素耐药特点见表2^［8］。

表2　各种肠球菌的万古霉素耐药特点

　　另有个别需万古霉素才生长的肠球菌，Fraimow等^［9］1994年报道了一株这样的菌株。该菌株从长期使用万古霉素治疗的泌尿系感染患者的尿液中分离出来。

　　三、肠球菌感染的治疗方法及药敏试验选药方案

　　根据肠球菌的耐药特点， 抗感染治疗分为3种情况。青霉素或氨苄西林的MIC在2～8μg/ml之间的粪肠球菌，单独用青霉素或氨苄西林治疗。较耐药的屎肠球菌，青霉素的MIC在8～32μg/ml之间，以青霉素和一种氨基糖类药物联合使用进行治疗。

　　HLAR菌株，青霉素和氨基糖苷类药物联合治疗无效，须使用万古霉素。对万古霉素耐药的菌株，治疗比较困难，没有特定的规律，可供选择的有四环素、氯霉素、喹诺酮类，泌尿系可考虑呋喃妥因或磺胺类。

　　做药敏试验选择药物时，须符合肠球菌的耐药特点，美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)药敏试验操作标准要求只做青霉素或氨苄西林(A组)，万古霉素(B组)和庆大霉素(C组)。泌尿系感染做喹诺酮类和呋喃妥因^［10］。

　　非泌尿系分离的肠球菌，A组为首选，两种药物做一种就可代表所有青霉素类药物的敏感性，包括苯咪唑西林，洛美霉素和氧哌嗪西林。青霉素药敏试验结果如为“中度敏感”，提示治疗应采用联合用药，一种青霉素加一种氨基糖类药。A组耐药，测万古霉素，耐药时须用庆大霉素或链霉素确定是否为HALR。当药敏试验结果A组药物敏感，即便已经做了B和C组药物的试验， 结果也不应报告临床。病人如果对青霉素过敏，报告万古霉素的结果。

⁵ cFU/ml。过夜培养混浊为HLAR。

　　稀释法筛选试验须用BHI。Swenson等^［2］的研究认为，肠球菌在MH琼脂上生长较差，结果不宜判定，用BHI结果很清楚，且重复性很好。不能使用加血液的MH培养基，否则抑菌环偏大或假耐药。

　　3.万古霉素筛选试验：肠球菌对万古霉素的耐药率增加惊人。有报道，1989～1993年，耐药率由0.3％增至7.9%。不仅如此，因常用的自动化仪器和纸片法试验会漏检一些低水平耐药菌株，耐药率还会更高。Tenover等^［8］评价了10种试验方法，认为传统的纸片法和几乎所有仪器方法、微量板方法均有程度不同的误差，有的极重要误差高达16％。常量的肉汤或琼脂平板药敏试验方法， 结果可靠。较为标准的万古霉素筛选试验方法如下^［12］。(1)条件： 培养基：BHI；药物浓度：万古霉素6 μg/ml；接种菌量：10⁵～10⁶ CFU/接种点；观察时间：18小时初步看结果，24小时读取最终结果。(2)操作：制备含万古霉素6 μg/ml 的BHI平板、备用。待测菌株制成菌悬液，浊度为0.5麦氏管。取菌悬液10μl点种在琼脂平板上，35℃培养过夜，约18小时初步观察结果，接种点有细菌生长，报告耐药。未见细菌生长，继续培养至24小时，仍未生长者报告敏感，生长者报告耐药。

　　使用筛选法，可以检出MIC在4～8 μg/ml之间的低水平耐药菌株，如酪黄肠球菌和母鸡肠球菌。

　　五、

　　纸片法和稀释法药敏试验，采用敏感的菌株作为质量控制菌株，NCCLS指定用ATCC29212(或ATCC33186)^［10］。

　　对于筛选试验， 目的是检出耐药细菌， 耐药为正结果。实验中， 除了敏感菌株外，还须用耐药菌株作为阳性对照， 进行质量控制。Swenson等^［13］建议用ATCC51299作为耐药的菌株。该菌株具有万古霉素耐药基因Van B，庆大霉素耐药基因 acc(6′)+aph(2′′)和链霉素耐药基因 ant(6)-I。药敏试验结果：万古霉素 mIC，培养24小时为16～32 μg/ml、培养48小时为 128 μg/ml；庆大霉素和链霉素MIC均 ＞2 000 μg/ml。ATCC29213和ATCC51299的质量控制标准见表4。

表4　筛选试验的质量控制方法及标准