NHS 酯是通过羧酸盐分子的碳二亚胺活化形成的反应基团（参阅碳二亚胺交联剂化学）。NHS 酯活化的交联剂和标记化合物在生理至弱碱性条件下（pH 7.2 至 9）与伯胺反应，形成稳定的酰胺键。反应释放出 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。
化学偶联伯胺的 NHS 酯反应方案。R 代表具有 NHS 酯活性基团的标记试剂或交联剂的一端；P 代表含有靶官能基团（即伯胺）的蛋白质或其他分子。
NHS 酯水解与伯胺反应产生竞争。水解速率随缓冲液 pH 值的增加而增加，低浓度蛋白质溶液中的交联效率降低。在 pH 7.0 和 0°C 下，NHS-酯化合物的水解半衰期为 4 至 5 小时。在 pH 8.6 和 4°C 下，该半衰期降低至 10 分钟。在不含伯胺的水溶液中，NHS 酯水解的程度可以在 260 至 280 nm 处测量，因为 NHS 副产物在该范围内吸收峰。
NHS-酯交联反应最常在室温或 4°C 下于 pH 7.2-8.5 的磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、HEPES 或硼酸盐缓冲液中进行（0.5-4 小时）。与伯胺缓冲液（例如 Tris，TBS）不相容，因为它们会发生竞争反应。但是，在某些步骤中，结合步骤结束时可添加 Tris 或甘氨酸缓冲液以淬灭（停止）反应。
低浓度叠氮化钠（≤3 mM 或 0.02％）或硫柳汞（≤0.02 mM 或 0.01％）通常不会明显干扰 NHS-酯反应，但浓度较高时会产生干扰。不纯的甘油和高浓度甘油（20-50％）也会降低反应效率。
Sulfo(磺基)-NHS 酯除了在 N-羟基琥珀酰亚胺环上含有磺酸根（–SO3）外，其他部分与 NHS 酯相同。该带电基团对整个化学反应没有影响，主要用于增加含有它们的交联剂的水溶性。此外，带电基团可防止Sulfo-NHS 交联剂穿过细胞膜，使它们可用于细胞表面交联。
Sulfo-NHS 酯反应方案用于与伯胺发生化学结合。R 代表具有Sulfo-NHS 酯反应性基团的标记试剂或交联剂一端；P 代表含有靶官能基团（即伯胺，–NH2）的蛋白质或其他分子。
NHS-酯试剂的溶解度随缓冲液组成和分子结构其余部分（例如，间隔臂）的物理性质发生变化。许多非磺化 NHS-酯试剂是非水溶性的，必须首先溶解在可与水混溶的有机溶剂中（例如 DMSO 和 DMF）才能添加至水性反应混合物中。因此，与非水溶性NHS-酯发生交联反应通常需要在水性反应中加入 0.5-10％ 的有机溶剂。
NHS 与Sulfo-NHS 交联剂的对比。DSS 和 BS3（磺基-DSS）的化学结构。DSS 不能直接溶于水，一旦溶解便会穿过整个细胞膜，在细胞内部发生交联。BS3 是水溶性的（在常规工作浓度下），带电后不能穿细胞膜内，而将 BS3 交联局限在完整细胞表面上。
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