副溶血性弧菌(Vibrio
parahaemolyticus)是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌,为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一,尤其是在夏秋季节的沿海地区,经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品,引起爆发性食物中毒。在非沿海地区,因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全,根据副溶血性弧菌的特性,进行下列检验,以便鉴别诊断。
第一节 副溶血性弧菌标准的检验方法
一、检验方法
(一)操作步骤
1.
分离培养:首先称取样品25g,加225mL3.5%灭菌盐水,用均质器打碎或用乳钵磨碎,接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个,同时取10mL加入100mL增菌液中,放37℃8~16h培养后,涂上述平板进行分离,37℃培养18~24h取出观察,挑取可疑菌落,转种3.5%氯化钠三糖铁斜面,37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检:将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄(葡萄糖产酸不产气)、上层斜面不变(乳糖、蔗糖不分解)、有动力、不产生硫化氢,进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验:将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水(0%,3%,7%,10%)于37℃24h培养后观察生长情况,在无盐和10%盐的胨水中不生长,在3%和7%盐的胨水中生长良好者,继续进行下列有关试验。
4. 生化试验:分别接种下列各类生化培养基,葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P,赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验,放37℃培养,除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外,其他均在24h观察结果。
5. 动物试验:将上述符合各类反应的副溶血性弧菌,接种3.5%氯化钠胨水,经37℃、16~18h培养后,小鼠腹腔注射0.3mL,观察2~3d,将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
(二)检验程序
图6-1 副溶血性弧菌检验程序
二、结果分析判定及注意事项
(一)样品处理
采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器,以无菌手续取有代表性的样品,样品必须尽快送检,不宜存放时间过长,副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快,但不适于低温生存,在寒冷的情况下容易死亡,防止待检材料冷冻,以免影响检验结果。
对采取的样品有时因受存放条件的影响(如低温冷冻或干燥时间过长等原因),使菌体处于受伤状态,故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养,但应注意为有利于细菌恢复,不宜选用抑制性较强的培养基,否则影响细菌生长。
样品经增菌8~16h后,转种平板进行分离,挑选可疑菌落,接种于含有3.5%盐的三糖铁培养基,此时挑选数目不应少于5个,尤其夏季海产食品混放,相互污染严重,时有不同型别的大量细菌存在,以防漏检。
(二)形态与染色
为革兰氏阴性无芽胞杆菌,易呈多形态,有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等,排列不规则,多数散在,偶而有成对排列,一般大小为0.3~0.7um×1~2um,单端一根鞭毛,有动力,运动活泼,两端浓染,在固体培养条件下能生长周鞭毛。
(三)培养特性
在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长,在无盐的条件下不生长,在含2%~3%氯化钠的培养基中生长最旺盛,氯化钠溶液浓度到达10%以上时不繁殖。
在肉汤和胨水等液体培养基中混浊生长,需氧性强,常在液体表面形成菌膜,在液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛,运行活泼。在固体培养基上,菌落常为隆起,圆形,稍混浊不透明,表面光滑,湿润,不产生色素。在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上,有些副溶血性弧菌可形成不规则菌落或片状扩散生长,在0.7%以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛(侧毛)。一般在20~25℃培养生长的周鞭毛较为稳定,而在37℃培养或24h以上的培养物,周鞭毛易于由菌体自发脱落,具有周鞭毛的菌株,在固体培养基上多表现扩散生长,单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落,不表现扩散生长。
培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同,都能对扩散生长有所影响,菌落形态也容易受条件的影响有所改变,如在嗜盐性平板上一般生长良好,而在SS琼脂平板上多呈较小的扁平菌落,不易挑起。在血平反上生长快可出现溶血环,在BCBS(硫代硫酸盐,柠檬酸盐,胆盐,蔗糖)和氯化钠蔗糖琼脂平板上,呈淡蓝或蓝绿色菌落。一般由腹泻病人初期分离者多为典型菌落,长期保存的细菌或条件不适宜时,常有菌落变粗糙,形状不整齐或菌落出现解离,有的在液体培养时呈沉淀生长现象。
pH生长范围为5~10,最适pH为7.2~8.2,发育最适温度为30~37℃。
(四)生化特性
本菌对葡萄糖产酸不产气,不分解乳糖和蔗糖,能分解甘露醇,产生靛基质,不产生硫化氢,甲基红阳性,V-P阴性,赖氨酸阳性,精氨酸阴性,鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性,溶血性多数阳性,有少数不溶血,主要生物化学性状见表6-1。
近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步,逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识,对其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表6-2。
表6-1 副溶血性弧菌的主要生物化学性状
项 目 | 项 目 | ||
耐盐性0% | - | 甲基红 | + |
7% | + | v ╟ p | - |
10% | - | 靛基质 | + |
葡萄糖产酸 | + | 赖氨酸 | + |
葡萄糖产气 | - | 鸟氨酸 | +/- |
蔗糖 | - | 精氨酸 | - |
甘露醇 | + | 溶血性 | +/- |
硫化氢 | - |
注:+阳性;-阴性;+/-多数阳性,少数阴性。
表6-2 副溶血性弧菌与其他弧菌的鉴别
菌名 | 氧 化 酶 | 葡 萄 糖 产 气 | 赖 氨 酸 | 精 氨 酸 | 鸟 氨 酸 | 靛 基 质 | 明 胶 液 化 | v ! p | 乳 糖 | 蔗 糖 | 甘 露 醇 | 肌 醇 | 阿 拉 伯 糖 | 甘 露 糖 | 鼠 李 糖 | β 半乳 糖 苷 | 硝 酸 盐 | 泳 动 | 盐胨水,% | |||
0 | 6 | 8 | 10 | |||||||||||||||||||
副溶血性弧菌v.parahaemoly-ticus | + | - | + | - | + | + | + | - | - | - | + | - | d | + | - | - | + | d | - | + | + | - |
溶藻弧菌 v.alginolyicus | + | - | + | - | + | + | + | + | - | + | + | - | - | + | - | - | + | + | - | + | + | d |
o1霍乱弧菌v.choleraeo1 | + | - | + | - | + | + | + | d | (d) | + | + | - | - | + | - | + | + | - | d | - | - | |
非o1霍乱弧菌v.cholerae nono1 | + | - | + | - | + | + | + | d | (d) | + | + | - | - | d | - | + | + | d | + | d | - | - |
拟态弧菌 v.mimicus | + | - | + | - | + | + | + | - | (d) | - | + | - | - | + | - | + | + | - | + | d | - | - |
河弧菌 v.fluialis | + | d | - | + | - | d | + | - | - | + | + | - | + | d | d | + | + | - | + | + | d | |
创伤弧菌 v.vulnificus | + | - | + | - | + | + | + | - | + | d | d | - | - | + | - | + | + | - | - | d | - | - |
梅氏弧菌 v.metschnikouii | - | - | d | + | - | d | + | + | d | + | + | d | - | d | - | d | - | - | - | d | - | - |
霍利斯弧菌 v.hollisae | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - | - | + | + | - | - | + | - | - | d | - | - |
v.damsela | - | - | d | + | - | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | d | - | - |
注:+90%以上为阳性;-90%以上为阴性;(+)迟缓阳性;d 11%~89%为阳性;(d)
11~89%迟缓阳性。
(五)溶血性试验
我妻氏用高盐血琼脂培养基,在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应,称此溶血性能为“神奈川现象”。
此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板,经37℃、24h培养,如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者,为“神奈川现象”阳性,若不出现透明溶血环或无明显溶血者,为“神奈川现象”阴性。
有致病性的副溶血性弧菌,多数为神奈川现象阳性,但亦有少数为阴性。
(六)动物试验
经上述检验的可疑菌株,用小鼠测定毒力,将16~18h的蛋白胨水或肉汤培养物,注射小鼠腹腔0.3~0.5mL,有毒力者可在5~10h发病死亡,长者有24h左右发病死亡。发病时有竖毛、运动不活泼,腹部紧贴罐底,呼吸困难,四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。将死亡小鼠解剖后,取心血等内脏进行分离,可检出试验菌的纯培养。对照动物观察2~3d无异常现象。
但应注意,尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡,有时不易区别,需要上述毓的检验后,进行毒力证实,综合判定结果。
三、培养基
(一)氯化钠结晶紫增菌液
成分:蛋白胨 | 20g |
氯化钠 | 40g |
0.01%结晶紫溶液 | 5mL |
蒸馏水 | 1000mL |
pH9.0 |
制法:除结晶紫外其他按上述成分配好,加热溶解,约加3%氢氧化钾溶液4.5mL,校正pH,加热煮沸,过滤,再加入结晶紫溶液,混合分装试管,121℃高压灭菌15min。
(二)氯化钠蔗糖琼脂
成分:蛋白胨 | 10g |
牛肉膏 | 10g |
氯化钠 | 50g |
蔗糖 | 10g |
琼脂 | 18g |
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 | 20mL |
蒸馏水 | 1000mL |
pH7.8 |
制法:将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中,校正pH,加入琼脂,加热溶解,过滤,加入指示剂,分装烧瓶100mL,121℃高压灭菌15min备用。临用前在100mL培养基内加入蔗糖1g,加热溶化,冷至50℃倾注平板。
(三)嗜盐菌选择性培养基
成分:蛋白胨 | 20g |
氯化钠 | 40g |
琼脂 | 17g |
0.01%结晶紫溶液 | 5mL |
蒸馏水 | 1000mL |
pH8.7 |
制法:除结晶紫和琼脂外,其他按上述成分配好,校正pH,加入琼脂,加热溶解,再加结晶紫溶液,分装烧瓶,每瓶100mL。
(四)3.5%氯化钠三糖铁琼脂
成分:蛋白胨 | 20g |
牛肉膏 | 5g |
乳糖 | 10g |
蔗糖 | 10g |
葡萄糖 | 1g |
氯化钠 | 35g |
硫酸亚铁铵 | 0.2g |
硫代硫酸钠 | 0.2g |
琼脂 | 12g |
酚红 | 0.025g |
蒸馏水 | 1000mL |
pH7.4 |