副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种分布极广的嗜盐性海洋微生物，海产品等中常带有此菌，由于生食海产品或加工烹调不当或生熟交叉污染，人们食用了带有大量此菌的海产食品后易引起急性胃肠炎。尤其在夏秋季沿海地区．是引起食物中毒的重要病原菌副溶血性弧菌的常规鉴定是分离培养、涂片镜检观察形态、嗜盐性试验、生化反应和动物试验等，检验耗时长、培养基消耗多、操作繁琐，且可因种种情况易造成漏检．不能适应食品卫生监督工作的实际需要，故寻找快速、敏感的检验方法已得到广泛的重视。PCR(polymerasechainreaction)是利用基因扩增技术。具有特异、敏感、快速的一种分子生物学方法，该技求在微生物、分子流行病学及疾病诊断等方面的应用显示出极大的优越性本文拟摸索、建立食品中副溶血性弧菌的PCR检测方法，实验试用较好。结果报告如下。
1、材料与方法
1.1 材料样品来源采自农贸市场的带鱼、海带、水产品计33份。副溶血性弧菌分离鉴定用培养基、营养肉汤按文献2进行副溶血性弧菌(VP)基因检测试剂盒购自上海荣剑基因工程产品有限公司，其中包括裂解液、反应液、阳性模板Tap酶、液体石蜡。副溶血性弧菌标准菌株中国药品生物制品检定所提供DNA扩增仪PE480型。电泳仪福建医用器材厂产。紫外透射仪上海分析仪器厂。台式高速离心机上海分析仪器厂。琼脂糖Sigma公司。TAE电泳缓冲液：50X，24．2gTris碱，5．71ml冰乙酸，1OmlO．5m01／LEDTANa2pH8．
1.2方法
1.2.1 茵液制备在灭菌的Eppendrof管中加人2ml营养肉汤，无菌接种少量副溶血性弧菌，混匀备用待测样品(带鱼的腮、内脏及体表、海带，水产品等)用灭菌生理盐水洗涤，2000r／rain离心3rain，然后加入2ml营养肉汤，37C培养4——5h后备用。
1.2.2 扩增样品前处理取上述制成的菌液20,ul-8000r／rain离心4rain-用无菌滤纸吸去上清．在沉淀中加入60l裂解液．置振荡器上振荡混匀-在100C沸水浴中加热10min．冷却至室温．8000r／rain离心4min后取上清液1Op．1两份．一份供直接扩增用-另一份再加^30ttl裂解液．混匀，再置100c沸水浴中加热8rain．8000r／min离心4rain后．取上清液10gl扩增。
1.2.3 PCR扩增按如下顺序：反应液3“】．灭菌水20，Tag酶2，标本处理液(阳性模板或灭菌水)10td．依次加入至500>1Eppendrof管中，摇匀后加30液体石蜡，短时间离心使之分层良好-置DNA扩增仪上+94C3rain后进入扩增循环，循环条件为r94C变性30s，55C退火3Os，72C延伸60s-其扩增30个循环．最后于72C保持5rain，以保持双链完整
1.2.4 扩增产物测定取1扩增产物经1_5琼脂糖凝胶(含0．5gg／ml溴乙锭)，经TAE电泳缓冲液电泳20min(电压为5v／era)，在暗室中用紫外透射仪观察，阳性者有一293bp的DNA扩增带．与阳性模板扩增带处于同一位置，阴性者无任何扩增带。
1.2.5 副溶血性弧菌常规培养方法，按文献2进行。
2、检测结果
33份食品样品用PCR方法测定．14份经DNA扩增后，均能出现阳性扩增带，但裂解一次者条带颜色较浅，二次裂解者阳性扩增带明显加强，与阳性对照一致，明性对照无任何条带。而用常规培养法仅检出副溶血性弧菌4份两法阳性率分别为42．4和12．1，PCR法明显优于常规培养法(P<0101)。3讨论由副溶血性弧菌所致的食物中毒国内外屡见报道·特别是温暖月份的沿海地区较为流行，
对疑似该菌引起的食物中毒．用常规培养法往往需7天才可报告结果，而用PCR法进行检测，从样品的增菌到报告结果最多只需5—6h．可明显地节省时间本次用此法检测33份食品中副溶血性弧菌．阳性率明显高于常规培养法，故PCR方法检测可疑致病菌具有快速、准确等优点本组实验通过对副溶血性弧菌PCR检测方法最佳条件的探讨．以建立完整、准确的方法。用巳知菌株所进行的PCR全部阳性．试验中发现经第二次裂解处理后效果较只裂解一次为佳，分析其原因，我们考虑可能由于第一次样品菌液浓度较高，第二次裂解是从第一次裂解样品中只吸10I苒重复进行，这样菌液浓度大大降低．同时从此也可推测．用PCR方法检测该菌时呈现出较高的敏感性。文献报道PCR对细菌的鉴定灵敏度达5．5CFU／ml口】，至于对该菌的确切最低检出量有待于进一步摸索。本实验结果表明-我们建立的应用PCR技术直接检测食品中副溶血性弧菌的方法，包括采样、增菌、PCR扩增以及扩增产物的检测具有敏感、快速等特点，该检测系统的建立为食品卫生中副溶血性弧菌的检测提供了一个新的有力工具，可用于食品卫生日常监测、食物中毒病原菌的快速查明及分子流行病学调查。
首页
