核酸的纯化主要方法：
超离心（提纯和分离最常用的方法，又分为①沉降速度超离心②沉降平衡超离心ρ=1.660+（G+C）%，相似条件下核酸密度ssRNA>dsRNA>ssDNA>dsDNA>tRNA和蛋白质环状DNA>线状DNA,DNA分子密度与构想有关，加入重金属AgHg）
核酸提取的一般步骤：
1、破碎细胞（物理方法&化学法和生物学法：①去垢剂②溶菌酶③蛋白酶—目前三法相互组合使用）
核蛋白的解聚和蛋白质的去除：
1.去垢剂法 2.有机溶剂法（1苯酚：有效地带白质变性剂，使用最多。它对核酸酶有一定的抑制作用，但对RNase却常常抑制不完全，且能溶解含polyA的mRNA。用饱和酚与氯仿可减轻这种现象，其中氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。同时加入适当的异戊醇（24:24:1）有助于消除抽提过程中的泡沫，使蛋白质层紧密，水相和有机相分层更好。酚的使用注意事项： 1）国外市售液化酚是清凉、无色的，无须重蒸馏便可使用。（氧化后变粉红色或黄色，不能用） 2）国内出售的多为结晶酚，应在120℃用空气冷凝管进行重蒸馏，以去除氧化物。3）酚的平衡：pH8.0缓冲液饱和酚，因为在酸性条件下DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平衡，使其pH在7.8以上。）
核酸的沉淀：
核酸是水溶性的多聚阴离子，它们的钠盐和钾盐在多数有机溶剂包括乙醇-水混合物中不溶，但在中等浓度的单价阳离子（NaCl、NaAc、NH4Ac）下也不会被有机溶剂变性。因此常用乙醇、异丙醇等有机溶剂作核酸的沉淀剂。然后通过离心并按所需浓度重溶于适当的缓冲液中。
用乙醇、异丙醇等有机溶剂沉淀核酸应注意的因素：
1）形成沉淀温度：几年前常规的乙醇沉淀在低温下（干冰-甲醇浴中）进行，现知已无必要。一般在0℃且没有载体的情况下，浓度低至20ng/ml的DNA也能形成沉淀。
2）在沉淀混合液中，使用的单价阳离子的类型与浓度：最为常用的阳离子如表，其选择很大程度上取决于个人偏好。
储存液（mol/L） 终浓度（mol/L）
乙酸铵 10.0 2.0-2.5
LiCl 8.0 0.8
NaCl 5.0 0.2
乙酸钠 3.0(PH5.2) 0.3
* 乙酸铵（2.0-2.5mol/L）常用与减少dNTP的共沉淀，在2mol/L的乙酸铵存在下连续沉淀两次，可除去DNA制剂中99%的dNTP。
* 但因铵离子抑制T4噬菌体多核苷激酶，所以提取的核酸要用于核酸化时则不能用乙酸铵。
* LiCl用高浓度的乙醇沉淀核酸（如RNA）时，常用LiCl(0.8mol/L)。LiCl在乙醇中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。
* 因氯离子可抑制蛋白质合成的起始，也抑制依赖于RNA的DNA聚合酶的活性，故如沉淀的RNA用于无细胞翻译或反转录时，应避免使用LiCl。
*各种分子大小的RNA在高浓度的LiCl(0.8mol/L)中的溶解度各不相同，故可用LiCl(没有乙醇)选择性的纯化大分子RNA。
*NaCl:含有SDS的样品应使用NaCl(0.2mol/L)。这时该去污剂在70%乙醇中仍保持可溶。
*乙酸钠：DNA和RNA共沉淀大多是用乙酸钠（0.3mol/L,PH5.2）
*注：高浓度的磷酸盐（>1mmol/L）或高浓度的EDTA(>10mmol/L)缓冲液，不宜用于乙醇沉淀，因为这些物质可与核酸共沉淀。（可通过常规柱层析或离心层析除去）
*沉淀极短的核酸小片段（<100个核苷酸）时，加入终浓度为0.01mol/L的MgCl2可改善沉淀效果。
异丙醇可选择性的沉淀DNA,而RNA不沉淀。
其他杂质的去除：多糖、脂类和小分子物质，主要是去多糖：例如CTAB法；去多酚类物质：PVP,能与多酚类物质结合形成沉淀。
不同类型核酸的分离：
提DNA中去RNA，提RNA中去DNA：
1.根据在NaCl溶液中的溶解度差异分离
DNA : 1-2mol/L NaCl 溶解度大
0.14mol/L NaCl 溶解度小
RNA : 0.14mol/L NaCl 溶解度大
2.用酶解法：比较有效
（1）RNase选择性的降解RNA。
RNase常含微量的DNase,必须预先加热除去（自消化）。
（2）DNase选择性的降解DNA
3.钙盐分步沉淀在核酸溶液中加入1/10体积的10%CaCl2，使DNA和RNA均成为钙盐，再利用DNA钙盐在1/5体积乙醇中形成沉淀，而RNA钙盐不沉淀而分离。
4.异丙醇选择性的沉淀大分子DNA,可除去RNA
5.苯酚抽提法
（1）在酸性溶液中，以等体积的90%苯酚反复抽提RNA，可除去绝大多数DNA。
（2）也可在提取过程中用90%苯酚抽提而直接将RNA和DNA分离。（RNA在水层，DNA与蛋白质沉淀于酚层，提总RNA时现常用此法。因酸性条件下，DNA分配于有机相）
6.活性炭吸附法：吸附掉小分子RNA。
核酸制剂的保存
1、保存中主要问题，主要是防止变性和降解。①加入螯合剂，抑制DNase ②pH7-8，防止酸变性。③一定盐浓度，中和电荷，保持双键结构。
2、保存方法：①DNA溶于TE溶液[10mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)-1mmol/L EDTA(Ph8.0)] -20℃保存，或SSC溶液（0.15mol/L NaCl-0.015mol/L柠檬酸钠） ②DNA置于75%乙醇中以沉淀形式储存于-20℃长期保存。③RNA则可冰冻干燥或在含0.3mol/LNaAc的75%乙醇中以沉淀形式于-20℃长期保存。
核酸制剂纯度的初步鉴定
核酸在260nm附近有最大吸收值，据此特性可定性和定量检测核酸和核苷酸。蛋白质在280nm有一定吸收峰，利用核酸在260nm与280nm的吸光度（A）即光密度（D）比值（A260/A280），可判断核酸样品的纯度。
纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0。
纯的样品可以根据260nm下A值计算出含量：
A值为1时，相当于：50ug/mL 双螺旋 40ug/mL单链DNA 20ug/Ml寡核苷酸
*核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30%-40%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的，此现象成为DNA的减色效应（hypochromic effect）。当核酸分子变性时，它在260nm处的吸收值便增大，此现象成为增色效应（hypertchromic effect）。
核酸溶液的紫外吸收也可以以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定出溶液的含磷量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数ε(P)。
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