5 疾病基因多态性研究的临床应用
长期以来临床上就认识到，同一种疾病其临床表现、对治疗的反应及预后在不同个体间都存在着显著的差异。例如，在糖尿病患者中并不是所有的患者都会发展为糖尿病肾病，只有约40％的糖尿病患者伴发糖尿病肾病；动脉粥样硬化患者心脑合并症的发生率也存在很大的个体差异；慢性肾炎中的IgA肾病，不仅临床表现多样，而且预后相差悬殊，其中只有20％～30％的患者较快地发展为肾功能衰竭等。在对许多药物治疗的反应性上个体之间也存在着很大差异。即便是疗效最好的药物也只对大约80％的患者有效。有许多药物仅对20％的患者有帮助。现已查明，疾病基因多态性是造成这些差异的重要原因。
人类最早研究基因多态性与疾病的关系是从组织相容性抗原(HLA)基因入手的。这类研究试图通过比较HLA基因不同位点等位基因在特定疾病患者和正常人群中的分布规律，来分析HLA基因型在疾病发生易感性方面的作用。在过去近20年中，国内外有大量有关这方面研究的报道，研究范围涉及到临床医学多个领域，已发表的研究工作可以开列出一长串HLA基因多态性与多种疾病，尤其是与一些自身免疫性疾病的发生相关的疾病。其中比较有代表性的成果是证明了HLA基因B27等位基因与强直性脊柱炎的发生明显相关。这些研究由于只是说明了某些疾病的易感人群，对疾病的病理生理、发病机制以及防治干预措施帮助不大，因此其应用受到了限制。
真正奠定基因多态性临床研究工作基石的是Rigat在1990年有关血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性的研究，他首次证实ACE基因多态性不同基因型个体血清中，ACE活性存在着差异。ACE是体内血管紧张素Ⅰ转化形成血管紧张素Ⅱ的一个重要限速酶。ACE基因第16号内含子中存在缺失（D）和插入（I）多态性，在人群中可以表现为DD纯合子、II纯合子和DI杂合子。Rigat的工作证实，人群中ACE基因DD型者其血清中ACE活性最高，DI型次之，而II型最低。这项工作首次从基因水平揭示了人类不同个体间，体内生物活性物质的功能及效应可能存在差异的本质，从而为探讨疾病临床表现在不同个体间的差异及对治疗反应性不同的内在因素开辟了一条新的途径。肾素-血管紧张素系统在维持人体内多种内稳机制中起着重要作用。ACE基因多态性的上述特点使它一时间成为心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病和肾脏疾病等相关领域研究的一个热点课题。肾素-血管紧张素系统在其级联反应过程中有四个关键基因参与，即肾素基因、ACE基因、血管紧张素原基因和血管紧张素Ⅱ受体基因。近年来围绕上述4个基因进行的一系列研究，使人们的认识更趋系统和具有整体概念。
目前，有关疾病基因多态性的研究已经涉及到很多领域。例如，凝血因子V基因多态性与血栓形成的关系；胰岛素基因多态性与1型糖尿病的关系；Ⅰ型胶原α1链基因多态性及维生素D受体基因多态性与骨质疏松的关系；载脂蛋白基因多态性与动脉粥样硬化的关系；雌激素受体基因多态性与乳腺癌及骨质疏松的关系；P53抑癌基因多态性与肿瘤发生及转移的关系等。尽管这类研究还能列举很多，但是，其研究的重点大都局限于分析一些目的基因多态性与疾病发生的相关性联系，缺乏根据基因型对疾病的一些亚临床表型的分析和研究，有很多工作忽视了对基因多态性与其功能之间联系这一重要环节，从而削弱了这类研究的临床实际应用价值。在过去的4年里，我们开展了一系列肾脏疾病基因多态性的研究，取得了一些新成果。下面拟通过我们自己的工作，以两个候选基因为例，对疾病基因多态性的研究思路进行阐述，并对疾病基因多态性研究的策略及今后的发展前景提出看法。
6 利用葡萄糖转运蛋白-1（GLUT1）基因多态性探索糖尿病肾病发病机制及其防治
在生物体内，葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，细胞葡萄糖的摄入需借助细胞膜上葡萄糖转运体。葡萄糖转运蛋白是调控细胞内糖摄入及糖代谢的第一道关卡，在介导糖尿病脏器损伤中起非常重要的作用。人类肾小球系膜细胞上有GLUT1的存在，系膜细胞在接受GLUT1基因转染后，这种过度表达GLUT1基因的系膜细胞，在生理糖浓度培养条件下，将表现出正常细胞只有在高糖培养基中才表现出来的细胞肥大和细胞外基质产生增加等改变。这就表明，系膜细胞GLUT1的功能状态对糖摄入的影响在某些情况下可能较细胞外糖浓度起更重要的作用。因此，糖尿病患者不同个体间肾脏系膜细胞GLUT1功能调控上的差别，有可能是部分患者易患肾脏损害的重要因素。鉴于上述事实，我们设想GLUT1是研究糖尿病肾病一个理想的候选基因。GLUT1基因在其第2号内含子限制性内切酶Xba识别序列中存在一个点突变，发生点突变的等位基因其XbaⅠ酶切点消失。因此，根据携带该点突变等位基因的不同，在人群中GLUT1可以表现为三种不同的基因型：XbaⅠ（＋／＋）、XbaⅠ（＋／－）和XbaⅠ（－／－）。我们对GLUT1基因型在糖尿病及糖尿病肾病患者中的分布进行了研究，发现XbaⅠ（－）等位基因的携带率在糖尿病肾病患者中明显高于糖尿病无肾病的患者，同时也比正常人群高。这一结果初步表明，GLUT1基因多态性与糖尿病肾病的发生有关，携带XbaⅠ（－）等位基因的糖尿病患者较不携带该等位基因者更容易发生糖尿病肾病。在这个基础上，我们又利用患者皮肤上的成纤维细胞，进一步研究了GLUT1基因型对其功能的影响。从GLUT1不同基因型个体获取皮肤标本，在体外进行成纤维细胞培养，比较GLUT1不同基因型成纤维细胞GLUT1功能的差异，发现携带GLUT1基因XbaⅠ（－）等位基因者，其成纤维细胞对葡萄糖的摄入明显高于不携带该等位基因者，主要表现为细胞GLUT1的亲合性增加，证实了GLUT1不同基因型个体细胞糖代谢确实存在着差异。这就从细胞功能上论证了具有GLUT1基因XbaⅠ（－）等位基因型的糖尿病患者容易罹患糖尿病肾病的可能机制。在临床上这种基因类型者应该被视为是发生糖尿病的高危因素。GLUT1基多态性的研究，不仅揭示了GLUT1不同基因型个体在糖尿病肾病发病率上的差异，而且也为寻找治疗糖尿病肾病的药物奠定了基础。我们的进一步体外实验表明，人肾小球系膜细胞GLUT1的表达受转化生长因子-β1(TGF-β1)的调控。TGF-β1能够增加系膜细胞GLUT1 mRNA的表达和糖摄入。中药大黄酸能够明显拮抗TGF-β1的上述作用，抑制系膜细胞GLUT1的过度表达。根据这一观察结果，我们设计了利用大黄酸治疗早期糖尿病肾病的方案。经过一年的随访在临床上证明了这一疗法的效果。
7 根据白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）基因多态性研究，揭示了IgA肾病与紫癜性肾炎的联系
IgA肾病是我国慢性肾小球肾炎中最常见的一种类型，其发病率约占我国原发性肾炎的1／3。长期的临床观察表明，IgA肾病不是一个均一的疾病实体，临床上可分为不同的亚型，不同亚型临床表型患者在免疫病理、临床表现和对治疗的反应及预后上均有所不同。其中尤以临床上表现为反复发作性肉眼血尿者特征明显，而且在临床和病理上与紫癜性肾炎有很多相似之处。对于这二者是否为同一疾病，在医学界不断有争论，但始终无法作结论。从基因背景分析IgA肾病临床表现产生的内因及其与紫癜性肾炎的关系，将有助于提高上述疾病的诊治水平。根据反复发作性肉眼血尿IgA肾病患者及紫癜性肾炎患者的临床表现特点，白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）应该是一个很重要的候选基因。大量的体外、体内和临床研究证明，白细胞介素-1（IL-1）在IgA肾病的发生以及肉眼血尿的发作中起重要作用，静脉注射IL-1能在IgA肾病模型动物诱发血尿的发作。此外，IL-1作为一个重要的炎症因子，能够通过自分泌或旁分泌的形式刺激肾小球系膜细胞增生和细胞外基质的产生，并且与肾小球新月体的形成、自身免疫性疾病患者的血管炎及皮肤损害的发生有关。IL-1ra能够竞争性地与IL-1受体结合，从而抑制IL-1的作用。因此，体内IL-1活性在很大程度上取决于IL-1ra对其的调控。IL-1ra基因第2号内含子中存在数目可变串联重复（VNTR）多态性，其重复序列长86bp，在人群不同个体中，该重复序列出现的次数从2次到6次不等。由于在IL-1ra基因这段重复序列中含有三个蛋白结合位点，这种结构特点提示该基因多态性对其编码蛋白质的产生有可能造成影响。通过对不同临床类型IgA肾病患者IL-1ra基因多态性进行分析，我们发现，IgA肾病群体其IL-1ra基因多态性的分布与正常人群相比并无明显差异，但若按IgA肾病的临床亚型分别加以比较，则发现表现为反复发作性肉眼血尿的IgA肾病患者，其IL-1ra基因IL-1RN*2等位基因的携带率明显高于正常人群，而且也比其它类型IgA肾病患者高。上述结果提示，反复发作性肉眼血尿型IgA肾病与其它类型IgA肾病在临床表现上的差异与患者的基因背景有关。根据这一线索，我们又对紫癜性肾炎患者IL-1ra基因多态性的分布进行了观察，发现紫癜性肾炎患者IL-1ra基因IL1RN*2等位基因的携带率明显高于正常人群，而与反复发作性肉眼血尿IgA肾病非常相似，结合上述两组患者在疾病的发病年龄、诱发因素、小血管病变以及遗传背景上的诸多相似性，我们由此得出结论：反复发作性肉眼血尿型IgA肾病实质上是紫癜性肾炎的一个亚临床表型，其在IL-1ra基因多态性上与紫癜性肾炎的相同表现形式有可能是二者之间的共同点。为了进一步揭示IL-1ra基因型与其表型之间联系的本质，我们对不同基因型IgA肾病和紫癜性肾炎患者外周血单核细胞在炎症因子刺激下IL-1ra的产生能力进行了研究，发现携带IL-1ra基因IL1RN*2等位基因者，其单核细胞在GM-CSF刺激后，IL-1ra的产生能力明显低于与之相配对的不携带该等位基因者。而携带与不携带IL1RN*2等位基因个体其单核细胞IL-1的产生能力并没有明显差异。证实了携带IL1RN*2等位基因者其体内IL-1ra的产生能力存在缺陷，这类个体在炎症情况下，体内IL-1的活性可能较不携带IL1RN*2等位基因者强。通过剖解不同临床亚型IgA肾病IL-1ra基因型的分布，不仅对反复发作性肉眼血尿IgA肾病和紫癜性肾炎的发病机制提出了新的观点，也为临床上尝试在上述患者中，根据IL-1ra基因型有针对性地选择IL-1ra进行干预治疗奠定了基础。
8 倡导疾病基因多态性研究的新观点
过去10年来，国际上有关疾病基因多态性的研究论文大量涌现。论文涉及临床医学各个领域，特别在心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、肾脏病、肿瘤、自身免疫病等范围做了大量工作，取得了不少成绩，但其重要意义及未来发展前景并未获得广大临床工作者的共识。从事此项工作者大都是从遗传学或分子遗传学的角度切入，研究工作的重点往往局限于基因多态性与疾病发生相关性，强调基因多态性与疾病易感性的关系，或是简单地了解基因多态性与疾病预后、转归的联系，忽视了疾病基因多态性（gene polymorphism）与临床表型多样性（phenotype polymorphism）的内在联系，没有把研究重点放在为什么不同的个体在相同的疾病会表现不同以及为什么不同的个体对相同的治疗药物会有不同的反应等的原因上。当然，要回答这些问题远比简单地了解某种基因多态性与疾病易感性的关联要复杂得多。它不仅需要有分子遗传学的知识，还要有深厚的临床医学基础。在熟知某一种临床疾病其表型多样化的基础上，需要精确地分析其病理生理上的特点，选择合适的候选基因，进一步调查不同基因多态性与不同临床表型之间的内在联系。在得到初步线索后，还要进一步从基因多态性所带来的该基因功能上的差异加以论证。只有确定能对疾病的病理生理状态施加影响，才可建立此种基因多态性与不同临床表型之间的联系。因此，疾病基因多态性的研究不仅需要有精密的分子生物学技术，更重要的是要有深入的临床分析及缜密的思考探索，才能揭开疾病本质的真实面目。目前国外不少研究者对同一种疾病（如心血管疾病）及同一种候选基因（如ACE）进行的基因多态性分析，结论可以完全不同，其根源都在于未能深入探索，抓住疾病多样表型的本质，即使做了不少工作，仍未能触及实质问题。
这类研究往往将某一个疾病患者作为群体与正常人群进行比较，满足于基因多态性是否与“疾病易感性”有关的观察，未深入到临床表型与基因多态性的联系；其次，他们也普遍地忽视了基因多态性与其功能之间联系的研究。
归纳过去这些年来在一系列肾脏疾病基因多态性方面的研究工作，我们总结出以下几点作为临床进行基因多态性研究的基本观点：
8．1 候选基因的选择要有明确的病理生理学基础。研究某种疾病基因多态性与其发病及临床表型的联系，所选择候选基因的基因产物在该病发病机制中所起的作用应该得到肯定，如上述GLUT1基因多态性与糖尿病肾病的研究和IL－1ra基因多态性与IgA肾病的研究等。
8．2 候选基因多态性对其所编码的蛋白质具有功能影响。一个基因序列中往往有多个多态性位点，但并不是所有的多态性位点都会对该基因所编码的蛋白质产生影响，也不是所有对基因产物有影响的多态性位点都位于基因的编码区。应该选择那些能对其编码蛋白质的产生有影响的基因多态性位点（perverse polymorphism）进行研究，使这类研究得到深化，并为特异性干预治疗奠定基础。
8．3 不同基因型的分布与相应临床表型之间有一定的联系。以往基因多态性研究常局限于将某一疾病患者做为一个群体与正常人进行比较，根据候选基因不同等位基因在上述两个人群中的分布特点来判断其在疾病发生中的作用。这种研究模型是不完全的。应该在上述研究的基础上，进一步分析不同基因型在同一类疾病不同亚临床表型者之间的差异，进而阐明疾病临床表型多样性的本质，为临床个体化治疗提供依据。如上述IL-1ra基因多态性在不同临床类型IgA肾病患者中的分布，IL-Lra基因多态性基因型的分布在IgA肾病和正常人之间并无明显差异，但是，在IgA肾病患者中表现为反复发作性肉眼血尿者，IL-1ra基因IL1RN*2等位基因的携带率明显高于其它临床类型IgA肾病患者，而且也比正常人高。进一步研究证实了携带IL1RN*2等位基因者体内存在IL-1ra产生的缺陷。
8．4 由于研究对象是多基因病，应根据疾病病理生理学改变，选择多个候选基因客观地从不同的侧面进行分析，做到逐一剖解，整体分析，既搞清某一基因多态性的作用，也要对不同候选基因之间的相互作用进行分析。
8．5 所观察的亚临床表型定义明确，如糖尿病肾病、反复发作性肉眼血尿等，以避免拟表型（phenocopy，一种环境条件引起的表型与某一特定基因所产生的表型相似）的干扰。另外，研究的样本量要足够大，具有充分的代表性。
8．6 疾病基因多态性的研究最好是由从事基础与临床的研究者进行跨学科的合作，才能事半功倍。
9 发展更具个体（个性）化的临床医学
疾病基因多态性研究既然揭示了同一种疾病不同临床表型的实质，也就为更具个体化的治疗打下了基础。例如ACE基因呈DD型者其血浆中ACE活力高，促使病情恶化，应用ACEI的指征强烈。这就使临床治疗能达到个体化的目的，而不是对同一病种患者泛泛地应用ACEI。换而言之，临床医学将更符合个体化的要求。
在基因多态性研究的引导下，临床医师将有可能预断不同的个体在同样的致病条件下会出现什么样的病理反应和临床表现，也就是不同的临床表型（clinical phenotype），不论在疾病的预防和治疗上都能采取更具个体化的措施。高血压病的治疗将根据基因多态性的研究选择更有针对性的药物，调整其剂量，而不是泛泛地使用ACEI、钙拮抗剂或交感神经受体阻断剂。合并症的防治也会更具个性，例如哪些患者应着重防治脑血管合并症，哪些患者应重点防治心血管合并症。
总之，不论治疗和预防工作都会朝着个体化发展，更具针对性。
疾病基因多态性的研究，使我们在认识疾病的思维方法上有了一个重大的突破。过去两个世纪以来，现代医学在认识疾病的规律上基本上遵循着下列模式：致病因子（外因）的作用特点、性质→机体的反应、表达→器官和组织的损伤、结局。这种三点论的模式在以外因为主导的疾病研究中，特别是针对感染性疾病常常是成功的。例如疟疾、血吸虫病、细菌性痢疾等等。当致病因子的作用特点得到详尽阐明后，其余的问题也就迎刃而解。然而在各种多基因病，内因起着更为重要的作用，上述的研究模式常常不能取得成功。例如前面所提到的IgA肾病，过去30年来，国际上数以千计的论文反复研究沉积在肾组织中IgA的来源、性质、致病作用，但始终未能揭开IgA肾病的发病机制及预防治疗措施。我们通过基因多态性研究，对于一部分病例（反复发作性肉眼血尿）的发病机制及治疗已初见端倪。糖尿病肾病的研究也反映了同样的规律，高血糖的致病作用固然是很重要，但特定基因在机体（不同组织器官）的反应及表达同样具有重要意义，甚或更具决定性作用。而后一因素（内因）在很大程度上是与基因多态性密切相连的。看来，今后在认识疾病的思维方法上，特别是对多基因疾病，应该更强调对内因的研究，多了解机体（器官、组织）对外来刺激（致病因子）反应上的差异性，毫无疑问，基因多态性在这方面将起着重要的作用。
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