dNTP和MgCl 2 的浓度（步骤 5D）.
dNTP. 用引物混合物 Y-4 检测了多重 PCR 反应中 dNTP 浓度的影响。氯化镁浓度保持恒定 (3 mM) ，而 dNTP 的浓度从每种 50 μ M 逐渐增加到每种 1200 μ M(Figure 4b) 。当 dNTP 浓度为每种 200 μ M 和每种 400 μ M 时结果最好，浓度继续增加时扩增被迅速抑制。降低 dNTP 浓度 (50 μ M) 不抑制扩增，但扩增产物的量会减少。 dNTP 母液对于反复冻融十分敏感，反复冻融 3–5 次后，多重 PCR 反应常常不能很好进行，扩增产物几乎完全不可见。为了避免这一问题，应分装出小份的 dNTP(25 mM each, 2–4 μ L, 10–20 次反应 ) ，冻存于 -20 ℃，使用前离心。 dNTP 的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。
MgCl 2 . 在 dNTP 浓度为每种约 200 μ M 的标准 PCR 反应中 MgCl 2 的浓度建议为 1.5 mM 。为测试 MgCl 2 的影响，将 dNTP 浓度保持在 200 μ M 进行多重 PCR 反应 (mixture Y-3) ， MgCl 2 浓度从 1.8mM 逐渐增加到 10.8 mM (Figure 4c) 。随着 MgCl 2 浓度的逐渐升高，扩增反应的特异性逐渐增强（非特异性条带消失），产物量逐渐增多 (10.8 mM) 。在 MgCl 2 浓度为 20 mM 的 PCR 反应中，产物几乎不可见，似乎反应被抑制了。
dNTP/MgCl 2 的平衡 . Taq DNA 聚合酶正确工作时需要游离的镁离子 (9) （不包括与 dNTP 和 DNA 结合的镁离子）。这也许是 dNTP 浓度增加时扩增反应被迅速抑制 (Figure 4b) 而增加镁离子浓度能消除这种抑制现象 (Figure 4c) 的原因。通过对各种 浓度 dNTP 和 MgCl 2 的组合实验发现，浓度为每种 200 μ M 的 dNTP 要得到最好的扩增结果需要 1.5–2 mM MgCl 2 ，而浓度为每种 800 μ M 的 dNTP 要得到最好的扩增结果至少需要 6–7mM 的 MgCl 2 。浓度为每种 200 μ M 的 dNTP 扩增反应要求的 阈 值为 1 mM MgCl 2 ，当 MgCl 2 低于这一阈值时，扩增会减少。
PCR 缓冲液（ Kcl ）的浓度 . PCR 缓冲液的比较 (Step 5, B–D).
KCl 或 PCR 缓冲液浓度 . 提高 PCR 缓冲液的浓度为 2x （或仅将 KCl 的浓度增加到 100mM ）可以提高多重 PCR 的效率 (Figure 4d 及 Figure 3, d–f) ，这种调节作用比调节 DMSO ，甘油或 BSA 更重要。通常产生长片断扩增产物的引物在低盐浓度下扩增结果更好，而产生短片断扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好，高盐浓度会使长片断扩增产物难于变性解链 ( 比较 Figure 4d 中 0.4x 缓冲液与 2.8x 缓冲液 ) 。例如， sY94 引物对 ( 熔点为 58 ℃ ) 在缓冲液的浓度为 0.8x 时扩增效果优于 sY88 引物对 ( 熔点为 58 ℃ ) 和 sY151 引物对 ( 熔点为 52 ℃ ) ，但在高的盐浓度条件下， sY94 引物对的扩增效果无明显优势。合适的缓冲液浓度可以克服产物大小和 GC 含量等因素的影响。
PCR 缓冲液的比较 . 我们还比较了原先提到的被称为 DMD 的多重 PCR 缓冲液 (6) 和相对简单的 KCl 缓冲液在多重 PCR 反应中的差异。 5x 的 DMD 缓冲液含有 83 mM(NH 4 ) 2 SO 4 , 335 mM Tris-HCl (pH8.8), 33.5 mM MgCl 2 , 50 mM β -mercaptoethanol （β－巯基乙醇）和 850 μ g/mL BSA ，缓冲液 DMD 的使用终浓度为 1x ，与 10% DMSO 和 1.5 mM each dNTP 同时使用 (1,2,4) 。实验表明用 1.6x 的常规 KCl 缓冲液比用 DMD 缓冲液扩增 DMD 基因 ( 引物混合物 X-1) 效果更好，明显见到更多的 PCR 产物 (Figure 4e) 。实验结果使用病人的 DNA 样品做了十二次重复，重复性很好。 KCl 缓冲液相对简单，便于调节和优化实验。低 dNTP 浓度时 Taq DNA 聚合酶的保真性更高 (9) 。使用 KCl 缓冲液（要求更少的 dNTP ）有利于对 PCR 产物做进一步的突变分析。
模板 DNA 的量和 Taq DNA 聚合酶 ( 步骤 5, A 和 D). 当每 25 μ L 反应体积中 DNA 的模板量为 30ng 到 500ng 时，混合物 Y-3* 未表现出明显差异 (Figure 4f) ，然而当模板量低于 30ng 时，某些 PCR 产物的量会减少。当模板量很低时（ pg 级的 DNA ），扩增的效率与特异性可以通过进一步降低退火温度来优化，有时甚至要降低 10 ℃ –12 ℃（数据未显示）。使用引物混合物 Y-3(Figure 5a) 来测试不同 Taq DNA 聚合酶的浓度 (Perkin-Elmer) 。 Taq DNA 聚合酶的最适浓度为每 25 μ L 反应体积中 0.4 μ L 或 2U 。也许是由于 Taq DNA 聚合酶中甘油浓度过高，加入过多的 Taq DNA 聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高。在 1.6xPCR 缓冲液中使用自制的五种不同来源的 Taq DNA 聚合酶（每 25 μ L 反应体积中加入 2U ）对 Y-4 引物混合物的反应体系扩增得到了相似的结果 (Figure 5b) 。
佐剂的使用： DMSO, 甘油 , BSA (Step 5E). 许多作者建议使用浓度范围为 5%–10% (v/v) 的 DMSO 和甘油来改善扩增的效率（提高产物量）和特异性（没有非特异性产物） (9) 。然而在多重反应中， DMSO 的使用会给出矛盾的结果。例如， 5% DMSO 增加了某些基因的产物量，减少了另一些基因的产物量，而对某些基因却没有任何影响 (Figure 5c) 。使用 5% 的甘油也得到了相似的结果。因此， DMSO 和甘油的调节对实验结果的影响要根据具体的实验来摸索。加入浓度达 0.8 μ g/ μ L BSA （比以前描述得更高）比加入 DMSO 和甘油更能提高 PCR 扩增的效率。 BSA 对任何基因的扩增都未产生抑制作用。
琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖 . 长度彼此相差 30–40bp 的多重 PCR 产物在通常使用的 SeaKem 或 NuSieve(FMC BioProducts) 3% 的琼脂糖凝胶可以很好的区分开。在低电场强度下过夜电泳可以优化每个 PCR 产物条带的电泳效果，特别是当 PCR 产物小于 400–500 bp 时。
聚丙烯酰胺凝胶 . 为了分离长度仅差几个 bp 的 PCR 产物（例如微卫星标记）需要使用浓度 6%–10% 的聚丙烯酰胺凝胶 (PAA 胶 ) 。非变性 PAA 胶可以有效的区分非多态性基因，但在这种胶上分离微卫星片断会出现不正常条带。例如在分析含有单拷贝人类第 12 号染色体的两个杂交瘤细胞系的人类第 12 号染色体上某个多态性位点时，对于每一个被检测的基因位点，在非变性 PAA 胶上都出现了两个条带 (e.g., Figure 5d) 。在常规的 6% PAA/7 M urea 测序胶上，每个被检测的基因位点都仅有一条带 ( 比较 Figure 5, d 和 e 的产物 ) 。
我们用一系列样品检测了多个参数来优化多重 PCR 。对于任何 PCR 反应，为了获得高特异性的扩增产物，退火温度和 KCl 浓度（盐浓度）的最优组合是最重要的。 Mgcl 2 浓度应当与 dNTP 的量成比例，对于任何反应这个比值可以是常数。虽然逐渐提高 MgCL 2 浓度可以增强反应的特异性，但是看起来退火温度和 KCl 浓度（盐浓度）对于获得高产量的特异性 PCR 扩增产物更为重要。在多重 PCR 中调节每一个基因的引物量也很重要。 Figure 1 给出了进行高效的多重 PCR 的有效方法。尽管无法完全列出影响 PCR 反应的所有因素。然而本研究中所提到的参数的优化提供了解决多重 PCR 中常见问题的基本方法。
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