实时荧光定量PCR原理和实验（二）

　　归一后的荧光信号再扣除本底，就得到DRn：DRn = Rn,样本- Rn,空白。DRn是最后构建PCR实时扩增曲线的纵坐标。 



　　无论绝对定量还是相对定量，在得到实验结果后，还要考虑数据之间的可比性问题。在实验操作中，取样都是以体积或重量为单位的，但是同样体积或重量的样本所来源的细胞数目并不一样，所以拷贝/μL或拷贝/ng的定量数据相互之间实际上并不可比。只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位后，才可进行严格意义上的比较。 



　　这种校正可以通过适当的参比来完成。参比一般选用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。校正方法为：[DNA]样本/ [DNA]IPC，或者DCT = CT,样本- CT, IPC。因为CT值与起始DNA拷贝数的对数是反比关系，可以证明，这两种计算方法在数学上是等价的。 



　　为了减少误差，目标基因和参比基因最好在同一反应管内同时进行定量测定，所以这种对照称为阳性内对照(Internal Positive Control，IPC)。要进行IPC归一化校正，定量PCR仪必须具备多色检测能力，最好是4色。否则，目标基因和参比基因只能分两管作定量，就不成其为“内”标了。 



　　5污染的预防和热启动 



　　为保证定量的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施有使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和热启动。UNG酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA。它在50°C激活，95°C灭活。由于商用PCR试剂盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链。在定量PCR开始前增加50°C的保温步骤，UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染。 



　　普通的Taq酶即使在室温下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入PCR试剂的过程中、正式PCR开始前就会完成少量PCR扩增，增加了背景，影响定量精度。而金牌Taq酶经过特殊修饰，常温下其活性部位被封闭，没有活性；只有经过95°C 10 min的热启动以后，封闭被解除，才能开始DNA链延伸，这样就最大限度地减少了杂讯的生成。 



　　6标准曲线、重复实验和阴性、阳性对照 



　　定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小。所以定量实验的每个样本至少要重复3次以上，严格的定量更应当重复6～8次，以满足小样本统计的要求。 



　　如果作绝对定量，则标准曲线需要在5个点以上。标准曲线使用的标准品是 

浓度已知的DNA样本，可以自己制备，也可以购买商品化的试剂盒。其PCR反应条件应当与未知样本的一致，以便在同一反应板上同时定量。 



　　阴性对照中不加模板DNA，而以水或缓冲液代替，用于检验是否存在PCR污染。阳性对照则用于检验PCR试剂和实验操作上可能出现的问题。如果实验中设立了IPC，则IPC既可以用来校正数据，也可以起到阳性对照的作用。 



　　7 TaqMan探针技术原理 



　　TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 



　　在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 

　　 

　　TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 

　　 

　　8 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。 

　　　

　　SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。 



　　9定量PCR仪简介 



　　目前在国内使用得比较多的荧光实时定量PCR仪有美国应用生物系统公司(Applied Biosystems，ABI)的7000、5700、7900、7700型和罗氏公司的LightCycler等。下面以ABI最新推出的7000型为例作简单介绍。 



　　7000型荧光定量PCR仪设计满足临床检验、医学研究和基础实验的要求，面向低通量至中等通量的用户。随机配置的定量PCR引物和探针设计软件Primer Express非常有用，因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针。 



　　7000型有实时动态(Real-Time)和终点读板(Plate Read)两种运行模式。实时动态模式用于定量，测定DNA或RNA拷贝数。7000型可以动态显示PCR扩增曲线的生成，定量的线性范围大于7个数量级，区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性（SNP）分析等。当然，7000型也可以作为普通PCR仪使用。ABI已经发布12万个商品化的定量PCR试剂盒，覆盖人类全部4万个基因，平均每个基因3个检测试剂盒，为运用7000、7700、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。 



　　7000型最大特色是具备多色检测能力，荧光检测的波长范围为530～590 nm，能够有效地分辨FAMTM / SYBR? Green I、VICTM / JOETM、TAMRATM和ROXTM等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。 



　　7000型支持两种定量化学：TaqMan荧光探针和SYBR Green I荧光染料。其熔解曲线(Dissociation Curve)功能用于判断PCR扩增反应是否特异，有无杂带生成。 



　　进一步阅读材料基本方法[1] Lie, Y. S. and C. J., Petropoulos. "Advances in quantitative PCR technology: 5′nuclease assays." Curr Opin Biotechnol 9: 43-48. 1998.[2] Orlando, C., P., Pinzani, and M., Pazzagli. "Developments in quantitative PCR." Clin Chem Lab Med 36: 255-269. 1998.绝对定量[3] Becker K., D. Pan and C.B. Whitley. 1999. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther. 10: 2559-2566, 1999.[4] de Kok, J.B., Hendriks, J.C., van Solinge, W.W., Willems, H.L., Mensink, E.J., and Swinkels, D.W. Use of real-time quantitative PCR to compare DNA isolation methods. Clin.Chem. 44(10): 2201-2204, 1998. [5] Wang X., X. Li, R.W. Currie, R.N. Willette, F.C. Barone and G.Z. Feuerstein. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1beta mRNA in ischemic brain tolerance. J. Neurosci. Res. 59(2): 238-46,2000.相对定量[6] de Kok, J.B., Ruers, T.J., van Muijen, G.N., van Bokhoven, A., Willems, H.L., and Swinkels, D.W. Real 

-time quantification of human telomerase reverse transcriptase mRNA in tumors and healthy tissues. Clin.Chem. 46(3): 313-8,2000.[7] Moody, A., Sellers, S., and Bumstead, N. Measuring infectious bursal disease virus RNA in blood by multiplex real-time quantitative RT-PCR. Virol. Methods 85(1-2) 55-64,2000.[8] Zhang, A.W., Hartman, G.L., Curio-Penny, B., Pedersen, W.L., and Becker, K.B. Molecular Detection of Diaporthe phaseolorum and Phomopsis longicolla from Soybean Seeds. Phytopathology 89(9): 796-804, 1999.