应用于实时定量 PCR 检测体系中的荧光探针主要有两种:一种是 TaqMan 探针,一种是分子信标探针。
Tyagi 和 Krammer(1996)首次建立了分子信标探针,在同一寡核苷酸探针的5'端标记荧光素、3'端标记淬灭剂(DABCYL)分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环(LOOP)与目的 DNA 碱基互补,噜扑环两侧为与目的 DNA 无关的碱基互补的臂。
无目的 DNA 时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCYL 吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的 DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,使两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。
影响分子信标探针构型变化的参数主要有:臂长、臂序列 GC 含量、扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如 Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在 Mg2+存在条件下,4～12个核苷酸可形成稳定的杂交茎。噜扑环长度至少应是臂长的2倍,才能保证探针与目标 DNA 杂交及荧光素与淬灭剂分开。TaqMan 探针是一段5'端标记报告荧光基团,3'端标记淬灭荧光基团的寡核苷酸。报告荧光基团如 FAM 共价结合到寡核苷酸的5'端。TET,VIC,JOE 及 HEX 也常用作报告荧光基团。所有这些报告荧光基通常都由位于3'端的 TAMRA 所淬灭。当探针完整时,由于报告基团与淬灭基团在位置上很接近,导致其报告荧光的发射主要由于 Forster 型能量传递而受到抑制。
在 PCR 过程中,上游和下游引物与目标 DNA 的特定序列结合,TaqMan 探针则与 PCR 产物相结合。Taq DNA 聚合酶的5'—3'外切活性将 TaqMan 探针水解。而报告荧光基团和淬灭荧光基团由于探针水解而相互分开,导致报告荧光信号的增加。TaqMan探针的3端则经过化学修饰,以防止其在 PCR 过程中被延伸。探针与产物的结合发生于PCR 的每一循环,但并不影响 PCR 产物的指数积累。
报告荧光基团与淬灭荧光基团的分离导致报告荧光信号的增加,而荧光信号的增加可被系统检测到,它是模板被 PCR 扩增的直接标志。
引物和探针都必须与模板结合(杂交),才能实现 PCR 扩增和探针的水解;与探针特异结合的 DNA 模板得到扩增时才能产生荧光信号。基于这两点要求,即使发生非特异性扩增,也不会影响检测结果。
荧光定量检测的主要影响因素在于所用探针的纯度以及镁离子浓度,二者在很大程度上决定了检测结果的真实性和可靠性。
探针的纯度直接影响探针荧光本底的高低。任何标记报告基团而无淬灭基团的分子都是污染源,未淬灭的报告荧光使探针的荧光本底增高,导致难以辨认由于探针裂解而产生的报告荧光的变化。
同时由于探针标记不完全,即只标记了报告荧光素或只标记了淬灭荧光素或二者均未标记上,这样,即使荧光探针与扩增产物结合,也不能检测到荧光信号的增长,很容易造成假阴性。另外,镁离子浓度的高低也直接影响了检测的灵敏度。
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