人原代牙周膜干细胞来源于人的正常牙组织，牙周病是口腔疾病中的常见病和多发病，常导致牙周支持组织破坏或缺损。目前，牙周支持组织重建主要依赖机械、药物或引导组织再生技术，随着分子生物学、组织工程学和干细胞技术的飞速发展，牙周组织再生工程技术成为牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cell，PDLSC）是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一。因此，关于牙周膜干细胞的研究逐渐成为热点。
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,它包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于伦理学问题在临床上的应用受到限制.成体干细胞通常以极少量的数量存在于局限的区域。从不同组织中分离成体干细胞目前尚无统一、理想的方法,主要是根据干细胞具有克隆形成能力的普遍特点和不同干细胞所特有的生物、物理学特性进行分离和鉴定的。
骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓基质中的干细胞,是目前研究充分、应用泛的干细胞。已有研究表明,牙周膜中存在着干细胞,表达间充质干细胞的标记物Stro-1,并具有多向分化潜能,称为牙周膜干细胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs),可作为牙周再生的种子细胞。干细胞在临床治疗中的应用越来越广泛,研究表明,其增殖与分化是影响治疗效果的关键因素。
干细胞的增殖和分化受多种内在机制和微环境因素的影响。微环境是影响干细胞移植治疗效果、影响组织再生的重要因素。在组织再生的过程中经常会遇到因遭到严重破坏而发生炎性反应的过程。干细胞处于炎性微环境中,其增殖和分化的调控很可能受到炎性因子的影响。
二、应用
人原代牙周膜干细胞可用于TNF-α对牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化及骨创伤修复影响的研究：
炎性微环境中的炎性分子包括内源性的炎性介质(TNF-α,IL-1β,PGE2等)以及外源性分子(细菌脂多糖lipopolysaccharide,LPS,磨损颗粒particulate debris,机械张力或剪切力等)。其中TNF-α是目前公认的重要的一个内源性诱生型促炎细胞因子,也是内毒素引起的感染性疾病直接关键的炎症介质。TNF-α通过激活靶细胞内MAPKS与NF-κB通路使细胞发生增殖、分化、炎症等应激反应。
NF-κB是一种广泛存在于体内细胞的核转录因子,调节细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体基因的表达,影响机体内的细胞分化、免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤生长等多种生物学功能。现有研究结果显示炎性因子能够影响成骨细胞特异性基因的表达、细胞外基质的分泌以及成骨细胞的凋亡。然而,这些研究大都以鼠成骨细胞系为研究对象,并没有说明干细胞向成骨细胞分化的过程中炎性信号通路的作用。因此,在组织再生过程中,慢性、长期、高浓度的炎性微环境对于成体干细胞增殖和分化的影响亟需深入的研究。
本研究采用免疫磁珠法分离PDLSCs和BMSCs,以不同浓度TNF-α刺激PDLSCs和BMSCs,探讨TNF-α对PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化的影响；并对这种影响的信号通路进行了初步探讨；同时进行体内实验,观察在BMSCs中阻断NF-κB通路对于骨创伤愈合的影响,以期更好地了解炎症刺激条件下成体干细胞的生物学特性以及基于成体干细胞的创伤修复过程,为临床研发新的更有效的牙周治疗方法开辟一条新思路。
TNF-α对PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化影响的研究组织块法分离培养人原代牙周膜细胞,复苏-80℃冻存的ST2细胞,传代培养,细胞生长状态良好后用生物素标记的Stro-1抗体,免疫磁珠正选法分离PDLSCs和ST2细胞中BMSCs,免疫细胞化学染色和矿化诱导初步鉴定其干细胞特性；MTT法检测不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs增殖的影响；PNPP法检测矿化诱导条件下不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs碱性磷酸酶活力的影响；实时定量PCR检测不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs成骨分化基因OSX,RUNX2,ALP,OC mRNA的影响；矿化结节茜素红染色法检测不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs矿化的影响。
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