| 细胞培养常见问题 1. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？ 要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月 ~ 一年。 2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用，及使用方法。 几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ◦C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ◦C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-24◦C保存。 3.培养用液pH对细胞生长的影响 由于，大多数细胞适宜pH为7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。 但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。 4.常用培养基及培养用液的渗透压范围 培养基名称 渗透压范围（mOSM） DMEM（高糖） 315 ~ 350 DMEM（低糖） 270 ~ 330 RPMI-1640 260 ~ 290 MEM-EBSS 280 ~ 310 MEM-NEAA 280 ~ 310 McCoy 280 ~ 310 MEM-a 280 ~ 310 M—199 275 ~ 305 IMDM 270 ~ 300 DMEM/F-12 280 ~ 310 F—10 270 ~ 300 F—12 275 ~ 300 培养基名称 渗透压范围（mOSM） L—15 280 ~ 320 D-Hanks 280 ~ 300 Hanks 280 ~ 300 PBS 275 ~ 300 5.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？ 不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力zui强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为： （1）０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ； （2）０.２５％胰蛋白酶＋０.０３％ＥＤＴＡ。 （3）0.25% 胰蛋白酶 溶液ｐＨ８.０～９.０；使用Ｄ－Ｈａｎｋ液配制。 多数细胞传代消化可使用０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ这种消化液。 6.培养基在使用过程中应注意的问题： （1）. 培养基在使用前需37 oC预热或在室温平衡后再使用。 （2）. 细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基焦化，将有害物质带入培养液中。 （3）. 尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。 （4）. 避免液体间、细胞间的交叉污染。 （5）.配制完全培养基时，配制的量在2周内用完为好。 7.血清的有关问题： 新生牛血清：新出生牛5天内取血制成 小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。 胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。 国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。 根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为： （1）.特级胎牛血清：40纳米过滤，内毒素含量≤10EU， 血红蛋白含量≤10mg/dl。 （2）.优等胎牛血清：经过3次100纳米过滤， 内毒素含量≤25EU/ml， 血红蛋白含量≤25mg/ml。 （3）.标准胎牛血清：3次100纳米过滤，低内毒素， 低血红蛋白含量。 （4）.活性碳/葡聚糖处理血清：激素含量大大降低。 （5）.透析型胎牛血清：次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。 8. 其他细胞培养用液：除培养基、血清、谷氨酰胺外，其他几种液体也属必须，不可省略。 （1）.双抗：200倍，（1ml/支）其终浓度为青霉素100U/ml；链霉素100ug/ml，-24 oC保存。 （2）.L-谷氨酰胺：100倍，（1ml/支）， 终浓度2mM，-24 oC保存。 （3）.丙酮酸钠：配制浓度50mM，4ml/支，终浓度为1mM/ml， -24 oC保存。 （4）.Hepes液：配制浓度1M（5ml/支），一支Hepes加入到200ml 完全培养基中，终浓度为25mM/ml，常温保存。 9.支原体污染及检测： （1）.支原体污染在细胞培养中zui常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的zui小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，zui小直径0.2um，可通过滤器。 目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测，形势不容乐观。污染率达30% ~ 60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。 （2）.支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。目前，支原体检测的方法有以下几种。 （a）.相差显微镜观察；（b）.低张处理地衣红染色法； （c）.荧光染色法；（d）.酶标法； （e）.PCR法：基础医学细胞中心使用该方法进行检测。 优点：灵敏度高，检测耗时短，样品量小 （只需50ul细胞培养用液上清）。 |
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