细胞发生凋亡时具有固有的形态特征,如细胞核表现缩小、染色质边缘化、凝集,凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起,且被细胞膜包裹形成的凋亡小体。
DNA特异性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合,从而使细胞核着色,在紫外光激发时会出现明显的荧光。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可以观察细胞染色质的形态学变化、膜结构及通透性的改变,从而鉴别凋亡细胞、正常细胞及坏死细胞。
细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测。
细胞凋亡的DNA化检测
DNAladder
提取凋亡细胞的基因组DNA,经电泳后染色观察可见180bp～200bp及其不同倍数的弥散状DNA条带,即DNAladder。DNAladder被视为经典的检测细胞凋亡的指标,但DNA凝胶电泳特异性虽高而灵敏度偏低,不适于检测ATCC细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。
TUNEL检测法
TUNEL法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA的方法。
其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180bp～200bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3′-OH的末端,依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色。
TUNEL法因其灵敏高而被广泛用于各种凋亡细胞的检测,由于在坏死细胞内也可能存在DNA,所以只有DNA链普遍断裂才能证明细胞发生凋亡。另外,在TUNEL法具体试验操作过程中,需要摸索细胞的固定及消化时间,以提高该技术的敏感性和获得较低的背景值。
ELISA检测法
应用ELISA方法也可以检测DNA,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度。
此方法既可定性又可以定量,而且适合检测大批量样本,不需要特殊的仪器。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DNA片段也被计算在内,进而导致结果偏高,因此不同的ATCC细胞系需要经过数次摸索才能确定zui佳检测条件。
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