1.用75%酒精喷洒整个培养瓶消毒，将其平躺置于培养箱中进行1-3小时的缓冲，.然后置于无菌操作台，打开瓶口，将其中的培养液去掉，再往其中加入5-6mL新鲜培养基(以T25培养瓶为例)并置于细胞培养箱中培养，根据细胞生长状况及培养基颜色变化对其进行换液以及传代，一般2到3天换一次液；
2.待细胞长满瓶底面积80%-90%，需要对其进行传代，传代比例为1:3到1:6；
3传代步骤：将0.25%胰酶-0.53 mM EDTA消化液置于37°预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5 ml PBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加1-2 ml预热好的胰酶，置于37°孵育消化（首次消化需时常取出置于显微镜下观察，以显微镜下细胞触角回收变圆、轻拍瓶壁见细胞脱落为较佳消化时间，记录较佳消化时间，以便于下次消化），消化好后加入3ml完全培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。
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