13例输血后TTV动态观察

自1997年10月Nishizaw等^［1］发表第1篇关于TTV的论文以来，许多国家开展了TTV的研究，我国北京^［2］、深圳^［3］等地也做了大量工作，但对于TTV的致病性，特别是输入TTV阳性血后临床上改变的调查较少。为了进一步阐明TTV的致病性，笔者对13名输入TTV感染血的患者进行了3个月动态观察，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

 1999年1月，选择产科2例，外科10例，内科1例，其中男性10名，女性3名，年龄31～77岁。输血前后对以上患者进行肝功能和TTV DNA测定，对其中1例TTV DNA阳性者进行分子克隆和部分核苷酸序列分析。

1.2 标本收集

采用经灭菌处理一次性带盖试管，对输血后患者空腹静脉抽血10ml，离心分离血清，分装后－20℃保存备用；输完血后取输血袋，血浆分装后－20℃保存，并进行TTV DNA的测定，发现献血阳性者，分期随访患者。

1.3 检测材料

 HAV-IgM、HBVM、抗-HCV、HDVAg、HDVAb、抗-HEV免疫试剂购于广州中山公司，抗-HGV酶联免疫试剂由302医院提供，肝功能检测采用美国ASCATM全自动生化分析仪。ALT、AST、TP、Alb、TBiL、DBiL、γ-GT液体型生化试剂由上海复旦张江生物医药公司提供，套式PCR试剂盒由北京军区总医院提供。

1.4 引物合成

根据Okmato等报道TTV基因序列^［4］，采用Goldkey软件在TTV ORF保守区设计两对套式引物，引物序列如下：T1:5’-AC AG AC AG AG GA GA AG GC AA C-3’；T2：5’-G GA TA CC TA TT AG CT CT CA T-3’；T3：5’-AA CA TG TT GT GG AT AG AC TG G-3’；T4：5’-CC TG GC AT TT TA CC AT TT CCA 3’其中T1、T2为外引物，T3、T4为内引物，扩增产物长272bp。

 1.5 TTV DNA的检测

 ①裂解：血清50μl，加裂解液150μl混匀，94℃10min。②分离：在裂解混合液内，每反应体系加入氯仿／异丙醇及饱合酚，震摇试管10s，混匀。在台式离心机上10000r/min离心，室温10min收集水相沉淀。③沉淀：异丙醇200μl，立即加已含DNA水相试管内，-20℃30～60min；离心：12000r/min离心，室温15min，用微量真空泵吸取上清及管边水珠。④第1次PCR：每反应体系加入第1次PCR反应混合液50μl悬浮沉淀，液体石蜡封顶，预变性94℃30s，94℃30s，55℃45s，72℃45s，35次循环，⑤取每反应体系，加第2次PCR反应混合液45μl，混匀分别取第1次PCR产物5μl，加入45μl反应混合液中，液体石蜡油封顶，预变性94℃30s，94℃30s，55℃45s，72℃45s，35次循环。⑥产物检测：用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳或2%琼脂电泳检测，溴化乙锭染色，在紫外检测仪上观察结果，设阴、阳性对照。

 1.6 PCR产物的分子克隆与测序

取第2次PCR产物，经酚／氯仿抽取，乙醇沉淀纯化后，直接于T载体连接，转入XLT-Blus宿主菌，挑取白色菌落，用PCR鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒，采用OPEN GENE型自动测序仪，进行DNA测序。

2 结果

2.1

13名患者接受的血液均为TTV DNA阳性 PCR产物电泳结果：分别对第1、2次PCR产物进行电泳，第1次未见阳性带，第2次阳性标本可见272bp DNA带，与预期大小一致(图1)。 图1 TTV DNA的PCR产物电泳图

2.2

PCR产物的克隆及序列测定结果 对1例肝炎患者血清PCR产物克隆测序表明，其核苷酸序列与Okamoto等^［4］报道的日本株(AB 008394)N22克隆同源性为75.4%，与国内深圳株(SZ1、SZ2)比较，同源性为73.9%、75.7%，与日本株(NA004)比较，同源性为88.6%。本株与JX2株比较同源性为81.74%。见图2。 图2 江西TTV分离株(JX1-JX2)与日本株(AB008394), 深圳株(SZ1-SZ2）相应核苷酸序列比较

2.3

输血前后检查结果(附表) 所有患者输血前的肝功能均正常，TTV DNA呈阴性，7例输TTV DNA血后变为阳性，并有肝功能异常，其中1个月后变阳性3例，两个月后变阳性2例，3个月后变阳性2例，阳性持续时间80d左右。

附表 输血前后TTV感染检测

本室的参考值：ALT：2～25U／L，γ-GT：8～30U／L 3 讨论

尽管对献血者及血液制品均进行乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的筛选，但输血后肝炎仍有发生。1997年底，日本学者以1例输血后的非甲～庚型肝炎患者血清中分离出一种新型病毒基因，命名为TT病毒(TTV)。为了探讨有关TT病毒的特征、致病特点，在输血后肝炎发病中的作用和地位，笔者对13名接受TTV DNA阳性血患者进行了动态观察，6例未见明显异常，7例ALT、γ-GT等酶学发生了改变，TTV DNA检测为阳性，经过献血者和感染者体内TTV基因序列测定，证明确属输血所致，说明输入TTV阳性血，对患者能产生一定影响，应引起临床上重视。

关于TTV基因变异研究资料尚少，Okamoto等^［4］根据TTV 1902-2257位核苷酸之间，356bp的序列，分析了日本78个分离株，认为78个分离株中76个可分成1组，另外两个1组，共4个亚组，即G1a、G1b、G2a、G2b。萍乡地区分离株与日本株(AB008394)同源性高，可能是同一病毒，不同的分离株，属于G1亚型的一种，TTV基因变异及不同亚型是否与其致病性有关，有待进一步研究。

参考文献

1，Nishizawa T,Okamoto H,Konishik,et al.A novel DNA Virus(TTV)assocoted transaminase levels in posttransfution hepatitis of unknow etiology.Biochem Biophys Res Commun,1997,241：92

2，周育森，周乙华，王海涛，等.中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学.中华预防医学杂志，1998，32：352

3，周伯平，马为民，孙 彤,等.一种新型肝炎病毒的分子克隆及核苷酸序列分析.深圳医学，1998，11：1

4，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA Virus acsocited with posttransfution hepatitis of anknow etiology.Hepatol Res,1998,10:1