本试验采用经典酶法测定了饲料样品的经典糊化度。该法在具体操作中还是比较耗时和繁琐，试验试剂的准备，尤其是酶溶液的制备，费用高、难控制，沸水浴中化学反应的沸液现象，试管的用量大，尤其是做多个样品的平行时，标记繁琐容易造成错误，一组数据的测试时间在4～6h之间，不能离人，造成很大不便。因此，建立一种预测饲料淀粉糊化度的快速检测方法，用来解决饲料生产厂家、用户及在线生产中的淀粉糊化度检测慢、检测难的实际问题已迫在眉睫。
1 试验材料和试剂
1.1 试样的制备
对应RVA制备的样品，取60目下北京美好希望有限责任公司的912鲤鱼成鱼料、910鲤鱼小鱼料、01#特配乳猪料、852小猪料、肉中鸡料、肉中鸭料、淡水鱼料、奶牛料八种颗粒料进行试验。
1.2 试验主要仪器和试剂
1.2.1 仪器
电子天平，Sartorius CP124s，Max120g，d=0.000 1g，北京赛多利斯天平有限公司生产；恒温水浴锅，其水温可调控在（40±2）℃；沸水浴锅；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 ，北京普析通用仪器厂生产。
1.2.2 试剂
缓冲液：将3.7ml冰醋酸和4.1g无水乙酸钠溶于约100ml蒸馏水中，用蒸馏水定容至1L，混匀，测定并用乙酸或乙酸钠将pH值调至4.5±0.05。酶溶液：将0.313 4ml脱支酶（浓度11 500U/ml)充分溶于20ml蒸馏水，配制成浓度为180U/ml的酶溶液，测试当天配制的溶液。蛋白沉淀剂：10%硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶液；0.5mol/l氢氧化钠（NaOH）溶液。铜试剂：将4g无水碳酸钠（Na2CO3）溶于约40ml蒸馏水中，加0.75g酒石酸，溶解后加0.45g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶解并定容至100ml。磷钼酸试剂：取7g钼酸和1g钨酸钠，加入40ml的10%NaOH溶液和40ml蒸馏水，煮沸20～40 min以驱赶NH3，冷却，加蒸馏水至大约70ml，加25ml浓的正磷酸（85%H3PO4），稀释至100ml。
2 试验方法
2.1 RVA（快速粘度分析仪）的糊化原理
对使用RVA测试淀粉质试样所得到的糊化曲线作了简要的解释和说明。采用典型的“加热→保持→冷却”测试循环。RVA是一种由微处理器控制，能对试样施加可改变的温度和剪切力，同时还能连续检测试样粘度的仪器，并且具备便捷的TCW操作软件，如可设定的测试程序、测试温度、搅拌器的转速、时间和pH值等，能很好地与实际加工工艺拟合。RVA的工作原理是将产品复煮，测量淀粉的转化程度来分析熟化度，类似于实际生产线上的调质机，可用于在线工艺控制、产品的开发、计量、输送、故障排除和竞争性产品的分析。
2.1.1 RVA糊化曲线
淀粉在水中因加热和冷却而发生的粘度变化一般均呈现有相同特征的糊化曲线（见图1）。
天然的淀粉颗粒通常在低于50℃ 时不溶于水。但在水中被加热超过某临界温度时，淀粉颗粒即吸收大量的水并溶胀至其原体积的许多倍。超出临界温度范围，淀粉颗粒即发生不可逆的变化，即凝胶化，以晶体的熔化、双折射的消失和淀粉的溶解为标志。
在测试的初期，因为温度低于淀粉的糊化温度，所以粘度值较低。温度高于糊化温度时，淀粉颗粒开始溶胀。受剪切力的作用，这些溶胀的淀粉颗粒彼此挤压表现出粘度增加。粘度开始增加的温度就是糊化温度。糊化温度就是熟化给定试样所需要的最低温度，此温度可能与试样中其它成分的稳定性有关并反映能量的消耗。
在一定的淀粉浓度（约10%）范围内，只要有足够数量的颗粒溶胀，粘度就迅速增大。淀粉颗粒的溶胀有一个温度范围，表明其行为的不均一性。糊化曲线中粘度初始上升段的陡度反映该温度范围的大小。变性淀粉（例如退火或交联的淀粉）的该温度范围通常较小。
随温度升高，淀粉颗粒会破裂并有更多的直链淀粉逸出到溶液中，支链淀粉随后也以较慢的速度逸出。淀粉颗粒的破裂及随后因机械剪切力的作用使多聚物重新排列将降低淀粉糊的表观粘度。随着凝胶化发生的这些综合过程就被称之为糊化。峰值粘度发生在粘度增加和粘度降低之间的平衡点。通常也测量峰值粘度出现时的温度（峰值温度）和时间（峰值时间）。峰值粘度显示了淀粉或混合物结合水的能力，与最终产品的质量有关，可作为一个指标来说明混合熟化机的粘性负载。
在测试的保持期，试样受到恒定高温（95℃）和机械剪切力的作用，淀粉颗粒进一步崩解，淀粉分子进入溶液并重新排列。该阶段通常表现为粘度衰减至保持强度（即热糊粘度或通过粘度）。衰减的速率取决于温度和混合的程度或施加到混合物的剪切力及物料自身的性质。试样耐受加热和剪切力的能力对于许多加工工艺都是重要的因素。交联的淀粉是抗衰减的。
随着混合物逐渐冷却，在淀粉分子之间，尤其是直链淀粉分子之间多少会发生重聚合，浓度足够时即可形成凝胶，粘度增加至最终粘度。该糊化曲线段即回生区，此时发生淀粉分子的回生或重排。
淀粉质试样的回生可能十分明显。回生与各种产品的质地密切相关。回生值高，可能与凝胶脱水或液体的渗析有关，在有这种质量缺陷的场合常使用取代淀粉来弥补。
应当注意，有时以最终粘度和峰值粘度之间的差值（通常对于大米），而不是以最终粘度和保持粘度之间的差值计算回生值。依淀粉和测试条件不同，最终粘度也可能是或不是平台。
最终粘度是在定义某种试样的品质时最常用的参数，因为它表明了物料在熟化并冷却后形成粘糊或凝胶的能力。
2.1.2 方法步骤
①开启3D-或4-型RVA，预热30min。运行RVA-4型TCW控制软件，设定挤压膨化饲料的测试程序（见表1），在同一分析程序下分析样品。输入文件名以便存储数据。②量取计算好的蒸馏水[应按14%湿基校正，校正公式为：
M 25.0+（M1-M 2）。式中：M1——与所用的微量对应的试样质量（g）；M 2——校正的试样质量（g）；W1——试样的实际加水量（%）；W2=校正的加水量（ml）。]，移入新样品筒中。③将粉碎好的样品移入样品筒内的水面上，每份添加量以②计算数值为准。④将搅拌器置于样品筒中，并用搅拌器桨叶在试样中上下剧烈搅动10次。若水面上仍有团块或粘附搅拌器桨上，可重复搅动操作，直至样品完全溶于蒸馏水。⑤将搅拌器插入样品筒中并将样品筒插接到仪器上。按下塔帽，启动测量循环。测试结束后，取下样品筒并将其丢弃。⑥由糊化曲线可测量糊化温度、峰值粘度、峰值时间、衰减值、最低粘度、回生值和最终粘度。
2.2 经典酶法
①原料的称量：每份称取400mg左右，4份样品应尽量相同，对应标号两份糊化样品如1＃和2＃；对应测定样品为1’和2’，置于25ml刻度试管中。②取全糊化样品两份，向样品中加入15ml缓冲液，混匀后将试管置于沸水浴中加热1h(其间摇动2～3次)，立即用自来水冷却试管，滴加适量蒸馏水使液面恢复到原15ml液面的位置，注意要保证试管充分冷却。③向两份测定样品中加入15ml缓冲液。再分别向两份全糊化样品与两份测定样品中加入1ml酶溶液。另取一空试管加入15ml缓冲液和1ml酶溶液，作为空白。在40℃水浴中保温1h，起初摇动1次，以后每15min摇动1次。④保温达1h时，加10%ZnSO4·7H2O 2ml，混匀，再加0.5mol/l NaOH 1ml。用水稀释至25ml，混匀，过滤。⑤准确吸取0.1ml滤液和2ml铜试剂，置于25ml刻度试管中。⑥将该试管置沸水浴中，煮沸6min，加2ml磷钼酸试剂，继续加热2min。⑦用自来水将试管冷却，将各试管加蒸馏水稀释至25ml，堵住试管口(可用保鲜膜)，反复颠倒试管使之混匀。⑧用TU-1901双光束紫外可见分光光度计在420nm处读取吸光值，糊化（熟化）度用下式计算。
3 试验结果
3.1 经典酶法测定值（见表2）
3.2 RVA特征值（见图2）
3.3 数据分析
利用SAS(Statistical Analysis System，统计分析系统)寻找经典糊化度值（Starch pasting value）与冷粘度(Cold Peak)、冷粘度面积（Cold Peak Area）、峰值粘度(Raw Peak)、峰值时间（Peak Time）、保持粘度(Hold Strength)、衰减值（Breakdown）、回升值（Setback）7个参数间的关系。
3.3.1 利用SAS统计软件建立经典淀粉糊化度与上述7个RVA特征值参数的线性回归方程，结果见表3。
①具体计算见下式：
经典糊化度=57.095 561 86-2.302 320 88×冷粘度-0.137 436 69×峰值粘度+0.203 351 19×保持粘度+0.064 001 02×回升值-22.411 928 37×峰值时间+3.353 665 47×冷粘度面积。
从回归系数可以看出，冷粘度、峰值时间、冷粘度面积的系数绝对值较大，对经典糊化度的影响较大；而衰减值、回升值的系数绝对值很小，接近于0，对经典糊化度的影响很小。
②模型的评价见表4。
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从图3可以看出，经典糊化度的预测值与真值接近直线y=x，说明预测值基本上等于真值，预测效果良好。
3.3.2 寻找最终粘度（Final Viscosity）与冷粘度(Cold Peak)、冷粘度面积（Cold Peak Area）、峰值粘度(Raw Peak)、峰值时间（Peak Tiｍe）、保持粘度(Hold Strength)、衰减值（Breakdown）、回升值（Setback）7个参数间的关系，得出：
最终粘度=保持粘度+回升值。
3.3.3 寻找最终粘度与经典糊化度的关系（见图4）
从图4可以看出，最终粘度与经典糊化度没有明确的函数关系，且Excel处理得到的相关系数R2=0.470 419，说明两者之间的相关性很小，找不出一个合适的函数来拟合最终粘度与经典糊化度。
4 结论与建议
4.1 结论
①利用SAS统计软件建立起经典酶法的淀粉糊化度与RVA糊化图谱的7个特征值的相关性，得到线性回归方程：
经典糊化度= 57.095 561 86-2.302 320 88×冷粘度-0.137 436 69×峰值粘度+0.203 351 19×保持粘度+0.064 001 02×回升值-22.411 928 37×峰值时间+3.353 665 47×冷粘度面积。
确定出冷粘度、峰值时间、冷粘度面积三个参数对经典糊化度的影响较大；而衰减值、回升值对经典糊化度的影响很小，接近于0。该模型预测结果与真值的相关系数R2=0.938 176，说明预测值基本上等于真值，预测效果良好。这就提出一种能够快速预测饲料淀粉糊化度的检测方法。
②本试验数据无法给出最终粘度与经典糊化度的函数关系，相关系数R2=0.470 419，分析原因可能是由于样本太少或是同样方法采到的不同种类样品的差异较大及本身试验误差等。
③RVA的检测时间短，自动化操作程度高，费用少，是一种很好的在线预测手段。
4.2 建议
①对于基于RVA建立起的快速预测饲料淀粉糊化度的检测方法，还需要大量采样，提高模型预测结果与真值的相关性。
②通过不同的采样方法，应用RVA深入分析颗粒饲料的糊化机理，研究样品的糊化特征曲线，分析品质差异。
③加大各种样品的采样数量，针对一类样品进行多点取样，多批次取样，尽量减少人为误差。
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