Real-Time PCR (qPCR)常见问题及解决方案

Real Time PCR(qPCR)，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，是一种利用荧光染剂检测每次PCR循环后产物总量的方法技术，是常规PCR的衍生反应。主要是通过荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。因其具有灵敏、特异、精确以及使用简便等优点，现已发展成为分子生物学研究中的重要工具。

常用术语

首先先定义几个术语先以确保澄清事实。

基本概念

1.1 实时定量PCR的简写

建议实时定量PCR (quantitative real-time PCR) 应当简写为qPCR，反转录PCR (reverse transcription–qPCR) 应当简写为RT-qPCR。用RT-PCR简写表示qPCR可以引起混乱，并且与传统RT-PCR的平常应用不符。

1.2 内参基因

内参基因应当指的是参照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。

1.3 TaqMan探针

TaqMan探针应指的是水解探针(hydrolysis probes)。

1.4 FRET probe

FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 荧光共振能量转移探针)指的是一种机制，基于2个荧光基团的电子激发状态之间的相互作用的基础上的发光/淬火。LightCycler型探针指的是双杂交探针(dual hybridization probes) 。

1.5 定量 quantification

牛津英语词典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰当的。

1.6 Cq

现在文献中使用的阈值循环(threshold cycle, Ct)，交点(crossing point, Cp)和分支点(take-off point, TOP) 与PCR反应周期中的术语不一致。这些术语指的实际上在实时仪器是相同的值，只是不同仪器厂家为了竞争给自己产品的特定定义，不具有准确性和清晰性。根据实时定量PCR的标记语言的数据标准(www.rdml.org)，建议同一使用定量循环(quantification cycle, Cq)这个术语。

1.7 基线（baseline）

一般默认为3~15个循环的信号值就是基线（baseline），是由测量的偶然误差引起的。

基线

1.8 阈值（threshold）

指在扩增曲线的指数增长区域内的适当位置上设定的荧光检出界限，一般是基线的标准偏差的 10 倍。

阈值

常见问题及解决方案

1.重复性很差

造成qPCR实验重复性差的原因有以下几点：

① 移液枪不准，加样不准确

这种情况下，我们可以更换性能更好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中

② 定量PCR仪在不同位置温度不一样

这个需要定期校准定量PCR仪

③ qPCR预混液未混合均匀

使用前应充分混匀qPCR预混液

注：重复性较为理想的扩增曲线STD<0.2

2.熔解曲线为非单一峰

这个可能的原因有以下几点：

① 非特异性扩增

可以根据设计原则设计新的引物，可通过梯度 PCR 对引物退火温度进行优化

② 出现引物二聚体，引物为非特异性引物

引物设计不合理导致的引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请按照以下方面进行优化：

（A）优化扩增条件，可设置梯度Tm，摸索最佳的Tm值

（B）引物浓度太高，适当降低引物浓度

（C）可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体

③ 模板有基因组污染

重新制备cDNA模板即可

3.Ct值出现过晚

① PCR产物太长

PCR产物不宜太长，一般100-50bp即可

② cDNA模板降解

重新制备模板，重复实验

③ 扩增效率极低

优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物

④ 反应体系中存在PCR反应抑制剂

加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验

⑤ cDNA模板浓度低

减少稀释度重复实验

4.内参基因Ct值正常，目的基因Ct值出现较晚

内参基因Ct值正常，说明试剂及操作步骤无误。目的基因Ct值出现较晚，可能原因为：

① 目的基因表达量偏低--重新富集RNA

② 目的基因引物扩增效率低：

将模板进行梯度稀释，以确定引物的扩增效率

降低退火温度

重新设计引物

5.扩增曲线异常，如“S”型曲线

1）反应体系引起的扩增曲线不光滑---扩增效率偏差（过高或过低）

A. 扩增效率过高

出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差可能导致出现抑制PCR反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。

解决方案：

① 去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线。如果效率重新回到110%以下，则分析良好；

② 对目的基因做标准曲线，一般用克隆该基因的质粒做梯度稀释，或用PCR 产物做梯度稀释，然后做定量扩增，通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在90%-110%;

③ 重新纯化模板，去除模板中存在的潜在抑制物。切记应延长干燥时间，以去除乙醇沉淀过程中的乙醇，或采用另外的纯化柱加入洗涤液将离液盐从硅胶纯化物中去除。

B. 扩增效率过低

主要表现在试剂浓度不适（主要是引物、镁离子和Taq DNA聚合酶），尤其是在多重实验中，引物对Tm差异超过5°C 以及热循环条件不合适的情况下，试管中各种同源物质的竞争作用可造成反应效率低下。绝对定量表现：扩增效率＜90%。

解决方案：对上述因素逐一排除后进行调整优化实验体系。

C. 个别扩增曲线异常

如个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。

解决方案：进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

2）仪器设置不当引起的曲线异常

基线设置不当，如扩增曲线断裂或下滑（基线的终点值大于Ct 值）。减小基线终点(Ct 值- 4)，重新分析数据;

A.基线范围和阈值设置不当

基线范围和阈值都是人为设定的参数。二者一般由仪器自动默认为合适值。在对同一程序中的多种试剂盒或化学剂进行评估时，经常出现阈值设置不当造成不同组别数据的扩增曲线差异：软件自动选择的阈值更适合平台更高的曲线，这将导致数据组中的Ct值出现偏差，因为其最佳阈值比此值更低。因此，需对每个数据组进行独立研究，这样才能根据具体情形选择最佳阈值;

B.Rox 添加不当

表现为扩增曲线呈锯齿状且不连续，需校正参比染料。

6.绝对定量时标准曲线线性关系不佳

① 加样误差

加大模板稀释倍数，提高加样体积

② 标准品降解

重新制备标准品，重复实验

③ 模板浓度太高

增加模板稀释倍数

7.绝对定量中通过以下参数对qPCR结果加以判定

A.相关系数（R2）：＞0.98，越接近1，结果可信度越高。R＞0.99 或R2＞0.98；

B.标准曲线斜率：-3— -3.5，100%扩增效率对应的斜率是-3.32；

C. PCR 扩增效率（E）：90%-110%，越接近1，越理想。其对应的斜率为-3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1；

D.检测灵敏度确认：35Cycles 内可得到好的定量结果，如果采用SYBR 检测方法，30cycles 内无非特异性产物扩增；

E. NO template control （NTC）确认：35cycles 内无引物二聚体产生；

F. 重复性:STD＜0.2。