光谱流式与质谱流式之“争 ”

质谱流式技术是近来年发明的一门新兴技术，它利用金属同位素标签替代荧光标签，并利用质谱对标签进行定量，通过结合质谱和流式细胞技术，可以同时对单细胞进行超多参数、无需补偿的测量，大大增强了评估复杂细胞系统和过程的能力，弥补了荧光流式的不足。其高通量、高灵敏度和高稳定性的特点尤其适合于免疫、肿瘤、血液、药物和遗传学等学科的研究中。

流式细胞技术在生物研究中有非常广泛的应用，然而随着科学工作者对研究精确度越来越高的要求，以及大数据所能产生的结果准确度的追求，引领了一门新兴技术的崛起，即质谱流式技术的创新。与传统流式技术比较，质谱流式很好地覆盖了原来技术的不足，给许多研究带来了极大的便利。在生物研究方面便是如此，其高通量、高灵敏性和高稳定性的特点与许多领域研究要求十分匹配，尤其在免疫、肿瘤、血液等高度细胞异质性的学科或是药物、遗传学等高通量的学科以及细胞分子生物学、生物化学等基础学科的研究中。

一）质谱流式细胞技术发展历史

2009年，多伦多大学的Scott Tanner及其同事将电感耦合等离子体（inductively coupled plasma，ICP）的质谱方法应用于测量细胞内外事件，开发出质谱流式细胞仪（cytometry time of flight，CyTOF）［1, 2］以及相关试剂，由DVS Sciences公司生产和分销。2012年，Nolan一篇应用质谱流式测量细胞周期的文章引起了人们对该技术的关注，被誉为是“流式细胞技术的一次革命”。2014年，美国Fluidigm公司收购DVS Science公司以及CyTOF技术，后来又推出条形码试剂盒、金属标记试剂盒和预联抗体等商业化应用以简化流程、减少数据采集时间、提高数据质量［3］。2014年，中国首台CyTOF2质谱流式细胞仪正式引入于厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室。

（二）质谱流式细胞技术工作原理

质谱流式与传统荧光流式细胞技术工作流程基本相同，只在两方面有所改动：一是由金属标签替代荧光标签，二是采用元素-电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）来定量同位素标签。用金属同位素标记靶特异性抗体，然后与相应细胞结合；到目前为止，质谱流式研究的标记元素和同位素包括钇（Y）、铟（In）、镧系元素（Ln，从La到Lu，Pm除外）、碘（I）、镉（Cd）、碲（Te）、银（Ag）、钯（Pd）、铑（Rh）、铱（Ir）、铂（Pt） ［4］。ICP-MS主要由氩等离子体、四极管和飞行时间探测器（time-of-flight，TOF）组成；氩等离子体可以使样品汽化、打破所有分子键，并从每个原子中剥离一个电子，产生带电荷的自由原子；四极管则用来选择相对分子质量范围为80~200的离子，使金属保持一定的电荷和质量范围，过滤掉不需要的离子；在TOF中，所有离子通过已知强度的电场加速，并且测量这些离子在已知距离上到达检测器所花费的时间，而该“飞行时间”与离子质量有关［2，5］。

总工作流程是：先用稀有重金属同位素通过螯合蛋白共价连接到抗体或其他探针上；在标记抗体后，细胞以单细胞悬浮液的形式被引入雾化器；细胞通过氩等离子体产生离子云，在TOF中按质荷比分开；最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面或内部的信号分子数据，并通过专业分析软件对获得的数据进行分析，从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察［3，6］。

（三）与传统流式技术的对比

质谱流式最大的特点是使用金属标签。其优势在于：（1）金属标签的多样性在理论上确保可以对单细胞进行上百个参数的检测；（2）稀有重金属元素在细胞内很少出现，因而减低了背景信号；（3）由于ICP对元素高超的分辨能力，不需要进行补偿或矫正；（4）质谱流式细胞仪中测得不同元素之间灵敏度相当；（5）这种方法使得在单细胞水平上测量新的金属参数，包括铂（一种抗癌药物）、钡（一种MRI成像对比剂）、碘（放射性碘疗法）和金（用于实验性自身免疫疗法）。其他优点还包括多参数数据可以在单细胞水平进行深层分析以及多样性分析；稳定性高，不同时间对同一标本检测结果变异系数≤3%。

然而，金属标签也带来了许多问题：（1）金属标签做成的商品化探针为螯合聚合物，它最多允许100个左右的离子附着在抗体分子上，对信号水平设置了上限；（2）质谱流式细胞仪的吞吐量被限制在1 000个细胞/s左右，细胞注射和清洁程序比较耗时，增加了每份标本的运行时间；（3）无法运用传统流式中的前向散射、侧向散射功能（用来测量细胞大小和粒度），也不可以回收分选的细胞用于随后的功能分析；（4）使用成本较高。

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随着CyTOF的生产、更新以及所能得到的更广更深的数据结果，越来越多的学者研究相关技术或使用该技术应用于各个领域并发表文章。其中最多涉及的学科为免疫学，其次为生物化学、肿瘤学、血液学、遗传学及药理学等。目前，应用质谱流式细胞仪所发表文章大部分来自于美国斯坦福大学的NOLAN实验室及BENDALL实验室。他们重点聚焦研究人类造血和免疫系统，进行了骨髓造血细胞亚群分析［1］、树突状细胞亚群分析［7］、B细胞分化过程分析［8］、细胞毒T细胞分化及亚群分析［9］等；以及在健康或者疾病状态下的细胞内信号调控机制。同时，他们也在质谱流式细胞仪使用功能提升方面做了相关研究［4，10］。

（一）免疫学相关应用

通过检测多标记组合，CyTOF能够帮助发现潜在的有关键功能的细胞群体；或获得对患者免疫系统状态的全面视图，展示免疫细胞的发育和信号传递的复杂性。最早使用这项技术的是Bendall等将CyTOF应用于健康人骨髓造血细胞，构建出造血分化模型，并探索不同免疫细胞亚群在药物干预下的不同反应［1］。CyTOF也可以帮助对各免疫细胞进行精确分型和亚群分析。2014年Bendall等［11］针对健康人骨髓中B细胞发育进行研究，确定了不同成熟阶段的细胞信号、增殖和细胞死亡的协调点；并发现一种新的细胞亚群。应用CyTOF研究各类免疫细胞集群（亚群）、分析细胞内信号变化，都是基于对免疫细胞上各类特异性标记物和细胞内表位的认识上，因而对健康和病理状态下人体免疫系统的细胞图谱以及信号网络有了更深的理解，这样的流程可以应用于各类疾病，例如Winkels等［12］应用单细胞测序和质谱流式技术建立动脉粥样硬化免疫图谱；Mrdjen等［13］应用质谱流式与基因定位系统，来识别、定位和表征哺乳动物中枢神经系统中的多个不同的免疫群体。

（二）肿瘤学相关应用

CyTOF在肿瘤学科的应用，主要在两个方面：一是揭示肿瘤和免疫微环境的组成，并确定新的免疫治疗靶点和治疗反应的生物标志物；二是了解单个癌细胞内的信号网络［5］。在肿瘤相关研究中，大多是使用精心设计的20~40个标记组成的面板，分选出各个细胞亚群，并根据特异性表达标记检测和挑选出关键的/罕见的细胞亚型，以揭示肿瘤浸润的免疫细胞的表型多样性以及异质性；同时可以比较用药前后细胞内信号的变化与否，潜在地预测治疗反应（疾病预后）或发现药物敏感或耐药的机制。例如在一研究高级别浆液性卵巢癌中发现，共表达波形蛋白/cMyc/HE4的细胞亚群可能与预后以及铂类耐药的机制相关；在一研究早期肺腺癌中，绘制了与早期肺腺癌相关免疫图谱，并发现Foxp3+/CD3比率可能是早期肿瘤复发的有力预测因子［14, 15］。通过了解或改造那些关键细胞亚型群体与疾病的关系以及肿瘤组织的微环境浸润等信息，可以更好地了解癌细胞动力学并设计更有效的治疗策略。此外，由于获得肿瘤标本和制备可行的单细胞悬液在实体肿瘤中较“液体肿瘤”更加困难，CyTOF在固体组织和肿瘤的研究中尚未得到广泛的应用。目前的解决办法包括将福尔马林固定的、石蜡包埋的组织分解成单个细胞，对此进行质谱流式分析，或它们可以直接用于另外的新技术，例如成像质谱细胞术、组织单上皮细胞内信号解聚与质谱术［16］。而制备单细胞悬液则应进行精心设计、控制良好的研究，设计和优化解聚和存储方案［5］。

（三）血液学相关应用

质谱流式在血液学中的应用与在免疫学和肿瘤学中类似。较早应用CyTOF分析血液学疾病的仍是Nolan和Bendall实验室的一批人，他们同时分析了白血病细胞的表面和内信号特征，提供了儿童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）主要表型的全面概述，明确描述了肿瘤异质性。并发现在健康标本中表现出的细胞表面和细胞内信号间紧密的协同调节，在AML中被打破，因而通常用于诊断的表面标记不能可靠地反映AML的细胞状态和功能［17］。类似流程的研究例如Edwards等［18］报道集落刺激因子1受体可以作为AML的一个新的治疗靶点，并提供了其中旁分泌细胞因子/生长因子信号转导机制，结合其他技术提示集落刺激因子1受体细胞可能是一肿瘤亚群细胞。Kordasti等［19］研究发现调节性T细胞（regulatory cells，Treg）亚群可以作为特发性再生障碍性贫血对免疫抑制治疗反应的预测标志物，并且发现特发性再生障碍性贫血患者的Treg在体外对白细胞介素-2敏感且可扩展，这提示了一种新的治疗方法。除了在诊断、治疗方面的用途，质谱流式也可用于预后评估。一研究使用质谱流式同时量化了标本中涉及B细胞发育的35种蛋白，然后每一个白血病细胞被匹配到它最近的健康B细胞群。通过机器学习确定了6个特征以预测患者复发的可能性，这个模型被称为“发展依赖复发预测器”，显著改善了目前建立的风险分层方法［20］。

（四）药物相关应用

细胞的异质性及其相互之间的相互联系是药物开发中的主要挑战，CyTOF使研究人员能够在单细胞水平上测量药物的效果，并更好地了解其作用机制。具体来说，在临床前研究中，质谱流式可以通过评估全血、组织或其他基质中不同细胞群体的免疫表型来评估药物的免疫毒理学；例如Sharma等［21］指出抗CTLA-4治疗黑色素瘤后，不会引起Treg细胞的下降并能引起CD4+及CD8+T细胞的升高。在临床研究中，它可用于安全性、受体结合率和药效学的评估，并可用于研究毒性的作用机制［22］。此类研究多与免疫治疗相关，例如在肝癌细胞系和原位肿瘤小鼠的研究中，发现MET可介导GSK3B磷酸化并激活，导至PD-L1表达下降。抗PD-1和抗PD-L1与MET抑制剂联合使用可产生抑制小鼠肝细胞生长的作用［23］；在黑色素瘤的研究中，发现抗CTLA-4和PD-1联合治疗效果大于单一治疗，CTLA-4和PD-1双重阻断治疗可以引起独特的细胞反应［24］。此外，最近提出将成像质谱细胞术运用于药物筛选，成像质谱细胞术数据扩展了单细胞中测量参数的数量，并将高维分析引入早期先导化合物发现的细胞筛选领域［25, 26］。

（五）其他学科应用

质谱流式对于免疫系统的多参数检测的贡献很大，而免疫系统参与各科疾病和健康恢复的过程当中，因而与免疫相关的各学科研究均有该技术的发展前景。值得注意的是免疫系统以外的靶细胞与特异性抗体结合后的应用质谱流式的相关研究；例如Porpiglia等［27］的一项研究中应用质谱流式同时分析细胞表面标记和关键的生肌转录因子，描绘出在活体骨骼肌中从干细胞到祖细胞的成肌过程，并证明这些祖细胞来源于Pax7+干细胞，在体外和体内均可表现出生肌功能。因此，找到感兴趣的抗体标记并与其他多种标记共同分析大量的单细胞是应用质谱流式的关键一环，在此基础上综合蛋白表达、信号变化，构建细胞图谱和细胞内信息网络，发现其中的共性或差异性以探索新的潜在的位点并运用到临床诊断、治疗、预后等各阶段的研究当中。

质谱流式细胞技术结合质谱和流式细胞技术，大大增多了可检测的参数，并无需补偿，弥补了荧光流式技术上的不足。不过，质谱流式吞吐量小、细胞利用率低、金属同位素灵敏性较低等的不足是该技术今后需努力提升的重点。在应用上，质谱流式基于多种细胞表面以及胞内表位蛋白质及其特异性抗体，能在同一标本中同时测量这些生物标志物，以区分出多种细胞群体及亚群、构建细胞内信号网络。类似的工作流程可以构建健康状态或疾病状态的细胞图谱、探索与疾病相关的关键细胞（亚）群或信号通道、挖掘药物或其他刺激下的细胞行为反应、发现可能与预后相关的因素，因而在临床病因、机制、诊断、治疗、预后等各步骤的研究中均有应用价值。而这种多参数的模式尤其适用于免疫学、肿瘤学、血液学、药物学、分子生物学等学科的研究中。然而，质谱流式技术对每种蛋白质特异的可靠抗体的依赖在一定程度上也限制了发现感兴趣的新蛋白质的效用。总之，质谱流式技术帮助研究工作者更展开更精细的研究，挖掘更深层的信息，从而能够在宏观及微观框架下表现出不同的研究效果。