双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的，它的理论基础是差吸光度和等吸收波长。在单位时间内有两条波长不同的单色光以一定的频率交替照射同一吸收池的溶液，然后经过检测器和电子控制系统，计算出这两个波长下吸收度的差值△A，与被测定物质的浓度成正比。
它与传统分光光度法的不同之处，在于它采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长λp, Primary Waelength）和参比波长（又叫次波长λs, Second Waelength）同时测定一个样品溶液。以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。
早期的双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper，一种用于双波长分光光度计中使光束按一定周期反射，遮断或通过的装置）处理后，以一定的时间间隔交替照射比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光度相减，就得到了差吸光度ΔA。
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