通过二代测序（next-generation sequencing，NGS）能够快速地对某个个体患者的数千个甚至数百万个DNA碱基对进行测序。这一技术快速出现并且获得成功，这预示着一个遗传学诊断的新的时代的到来。但是，新技术也带来了新的挑战，一方面是技术层面上的，即数据处理问题，另一方面是对结果的解释和后续遗传咨询方面的问题，而所有这些都会涉及到对NGS在诊断方面的精确定位问题，无论是今天还是明天都是如此。在着手购置进行诊断性NGS的机器以及有关技术之前尚有许多问题需要处理。基于上述情况，我们提出了这份指南。这些指南最主要的是解决NGS检测在罕见的和主要的单基因遗传病方面的问题，主要集中在对基因集合的靶向分析方面，或是通过特异性捕获检测，或是从全外显子测序中提取数据。原则上说，全基因组分析可能并且很快会被应用以提取相类似的数据，但全外显子测序也能够检测到疾病的其他分子特征，因此其应用会更加广泛。
有三个研讨会讨论了关于诊断性NGS的各个方面的问题。第一个是2013年2月25-26号在Leuven举行，其初步的观点于2013年3月7-8号在Prague举办的欧洲基因检测科学大会上发布。第二次研讨会是一个编辑研讨会，于2013年10月1-2号在Leuven举行，来自各个层面的人汇集在一起讨论并起草有关文件，第一版文件于2013年11月21-22号在Nijmegen举办的第三届研讨会之前完成。最后一次研讨会邀请了更多的利益相关者来对这个文件进行评价并形成声明。最终的文件被提交到欧洲人类遗传学会理事会，并于2015年7月1日获得认可。
本文所呈现的是在撰写指南过程中出现的声明，这个声明对指南进行了更加广泛的阐述，可以作为指南的补充材料。这个补充材料同时也包括了定义、一般介绍，更加重要的是，还包括了一些实际的病例和模板。
技术发展水平
从某种意义上说可靠的NGS技术平台尚不稳定，因为NGS的技术和应用变化太频繁太快速。但是，这并不妨碍将这项技术应用于诊断，因为NGS给病人提供了潜在的全方位的好处。暂时还不能将这项技术应用于诊断的原因在于其质量较差，还不能给病人提供足够的验证试验，目前也不能接受其应用于临床诊断。
声明01:根据目前的指南，NGS尚不能应用于临床实践，因为还没有一项可接受的验证试验方法。
必须事先明确诊断试验的目的是为了除外某种诊断还是为了确认某种诊断，因为这两者之间有显著的区别。这一区别主要取决于测试的完整性，这不但要求有不同的设置，更重要的是对诊断的不同看法。
声明02:实验室必须明确他们所提供的检测是用于除外某种诊断，还是用于确认某种诊断。
诊断/临床应用
将NGS应用于诊断的优势是可以在相对较短的时间内以相对较低的费用对很多个基因进行一次性检测，从而产生更多的分子诊断。
NGS的局限性取决于其所采用的平台和富集方法，要想获得高质量的诊断，在检测之前必须考虑到这两方面的问题，因为这会影响到对富集方法和测序平台的选择，以及必需进行哪些额外的测试。
声明03:必须在验证试验开始之前就讨论好要采用哪些试验或分析方法，以及采用这些试验或分析方法的目的，并且要将讨论摘要写入验证报告中。
“诊断产出”被定义为检出某种致病性变异并从而得出分子诊断的几率。这个数值是通过每个病人队列来计算的。这主要是从临床层面来评价NGS的表现，也是评价该检测的效率及其临床应用价值的好指标。
声明04:当一个实验室考虑要将NGS应用于诊断时，他首先必须考虑其诊断产出。
在实践工作中，诊断实验室往往倾向于提供基因集合。当考虑实施诊断性试验时必须要定义将某一个基因纳入到集合中所需具备的条件。在理想的情况下，这个问题应该在一个专业学会的层面上、通过多学科讨论的方式来解决，其目的是要给所有诊断试验编撰一个基因名单，更重要的是要协调各种遗传学检测方法。当然，从病人和医学从业者的角度来看，在整个欧洲能够通用并且获得同等价值则尤为重要。
声明05:对诊断目的而言，只有那些异常基因型和表现型之间的关系（无论是通过已发表的论著还是通过验证）已经明确的基因才能被纳入分析。
对于那些与缺陷的主要部分相关的基因被称为“核心基因”，其敏感性不会因为从Sanger测序转化为NGS而受到影响。一个强有力的例子就是BRCA1和BRCA2基因，通过Sanger测序再加上缺失/重复分析，其敏感性可以达到99%。这一点也同样适用于其他诊断产出很高的基因。增加其他基因无疑可以增加诊断产出，但这不能以漏检用传统方法就能够被检出的突变为代价。因此，能够增加多少检出率就成为确定核心基因名单的关键性决定因素。
声明06:为避免不可靠的检测，并兼顾病人的利益，“核心基因名单”应由临床和实验室专家共同制定。
实验室会不考虑指南的规定而采用不同的NGS检测设置（技术性的和诊断性的），事实上，也确实存在很多不适配于指南的各种情况。因此，我们提出了一个NGS诊断的评分标准，对不同的实验室进行公平打分和简易比较。
1.A类检测：实验室可以保证>99%的可靠参照要求或对不同编码区域和侧翼内含子区域的测序要求，用Sanger测序方法（或其他补充测序分析方法）来填充所有的缺口，并可以利用所采用的平台来进行额外的分析，如均聚物延伸分析。
2.B类检测：实验室明确描述哪些区域达到>99%的可靠参照要求或其他测序要求，用Sanger测序方法填充部分缺口。
3.C类检测：完全依赖于NGS本身的质量，不提供任何额外的Sanger测序或其他测序分析方法。
声明07:采用基于覆盖率和诊断产出的简单评分标准可以对不同的实验室所提供的诊断检测进行对比。
知情同意以及提供给病人和临床医生的信息
基于NGS的诊断性试验的应用取决于试验步骤、所采用的平台、滤过程序、以及实验室所采用的数据储存方法。因此，应充分告知咨询医生这一遗传学检测的局限性以及可能由此带来的不良后果。
声明08：实验室必须对每一次NGS试验都提供以下信息：靶向疾病、所检测基因的名称、已报道的检测范围、分析的敏感性和特异性，如果可能的话，还包括由于所检测基因的突变所导至的和临床表型不相关的疾病。
基于NGS的检测的结果主要基于主动发现和次要发现的几率，尽管主动发现是来自于和所检测疾病相关的基因中，而次要发现是来自于和所检测疾病的病因不相关的疾病基因中。
声明09：诊断实验室的分析渠道应集中在被研究的基因集合中，以避免产生次要发现，并且进行相应的验证。
在一个基因集合中产生主动发现的几率很低，这主要取决于所涉及的基因。但是，有可能会检测到隐性情况下的杂合突变，因此而检测到携带者。这将会对遗传咨询、生育选择等产生影响。
声明10：实验室应提供产生主动发现的几率方面的信息。
在实施一个基于NGS的试验之前，临床（遗传学）中心需要建立一个“主动发现和次要发现规范”，该规范必须和伦理委员会的决议相一致。它必须在实验室、研究所或国家层面上被决定，无论病人是选择性接受还是拒绝接受获得额外的、在最初诊断结果以外的信息。这个规范也应该详细说明是否应报告主动发现和携带者状态。实验室应明确他们可以管理好各种不同的意见。
声明11：如果一个临床中心或实验室决定给病人提供关于选择性接受或拒绝接受有关不相关疾病的携带者状态和次要发现的结果的选择权时，他们需要涵盖所有有关的可能性。
同时，必需要进行检测前遗传咨询，内容应该包括对预期结果以及可能出现的主动发现和次要发现进行讨论。咨询必需提供足够多的信息。
声明12：应向病人清楚说明关于对主动发现和次要发现的解释的实验室政策。
声明13：推荐通过书面的单张或在线方式向病人提供足够的信息。
验证
样本的质量牵涉到很多方面的参数，例如产生数据的数量、PCR扩增的比例和覆盖的比例。要达到诊断的目的，则只针对高质量的样本进行分析，因此就必需确定高质量的靶基因集合、外显子或基因组。
声明14：所有用于诊断的关于NGS质量的参数必须被精确描述。
NGS技术要求对运行特异性和分析/样本特异性特征进行监测。监测数据不必报告但应用于持续的验证中。
声明15：诊断性实验室必须针对以下三个方面建立相关质量检测的结构性数据库：（1）检测平台；（2）所有分析；（3）所有样本。
用于NGS工作流程的样本追踪方法非常复杂，包含了涉及到实验室部分和计算机分析中的多个步骤。
声明16：在对分析的评估当中应包括样本追踪和鉴别样本的条码设定的各个方面，这也包括在平台验证的内容中。
在平台验证中，实验室必须确认其所有的设备和试剂都必须满足制造商的要求。必须发现各个实验室自身的局限性并且在检测和数据分析的过程中充分考虑到这些因素。实验室应区分这些问题是来自检测平台环节、测试特异性环节、或数据分析环节。
声明17：一般平台验证部分应包括准确性和精确性验证，这一工作不必在每次测试中重复进行。
显然，每个测序技术都有其优势和劣势，生物信息工具必须反映出这些特征。
声明18：生物信息流程必须和所采用的技术平台相符。
诊断特异性的验证流程必须采用分析的灵敏度和特异度来进行评估。例如，适用于SNP检测的计算方法对于小的插入或缺失就不够准确。实验室必须明确这些特征，并且应充分测试各种不同的检测流程。
声明19：必须针对分析灵敏度和分析特异度分别建立不同的验证流程。
任何有关化学、富集步骤、生物信息学分析平台方面的改变都必须经过重新验证。
声明20：如果生物信息学流程（公共工具或商业软件包）发生改变，诊断性实验室必须用标准数据集对其进行验证。
包含所有相关变量的内置数据库提供了用于鉴别平台特异性产物的工具，对验证结果进行追踪，并提供了对位点特异性数据库和荟萃分析的互换。这一数据库应允许进一步的注解（如，假阳性、已发表的突变、分离变量，等），从而使诊断过程更加合理。
声明21：诊断实验室必须针对现行的相关变量建立结构数据库。
数据的储存必须坚持用标准开放式文件格式FASTQ，BAM和VCF，这些也可用于和其他实验室进行数据交换。当储存分析结果的时候，必须同时储存full-log文件。log文件应尽可能完善，使得从FASTQ数据到诊断报告的分析都可复制。可惜的是，尚无一个关于应储存什么数据方面的国际共识，但是，对数据的储存必须和国家的要求和常识。
声明22：诊断性实验室必须采取措施以保证对所有相关数据进行长期储存
在进行任何分析之前必须定义临床目标，即所有的编码区域再加上保守剪切位点。临床目标的确定则依据诊断试验和限定的基因集合而定。
声明23：在试验过程中必须确定报告的范围，即能够获得可靠结果的临床目标，而且必须告知临床医生（通过报告形式或数字通讯方式）。
声明24：对“可报告范围”的要求依据分析目的而定。
例如，目的是获得高诊断产出的外显子测序就不需要进行那些以获取在全基因组范围内的高覆盖率为目的所需要的额外分析，但却需要和临床医生明确沟通说明，这一检测不能用于除外某一种特定的临床诊断。
必须通过准确性、分析灵敏度、分析特异度、精确性这些指标来评价诊断性试验的表现。原则上讲，这些都不是新要求但却普遍被认为不易操作。但是，针对这方面的ISO标准是非常严格的。
声明25：无论何时对试验做出重大变更都应该检查质量参数，必须重新检测样本。实验室应事先确定好当改进或升级方法时要对哪种类型的样本以及多少样本量进行重新分析。
报告
NGS的结果应以清晰的方式发放，因为读实验室的报告的人既包括专家，也包括非专家。从实践的立场来说，有临床意义的结论、相关性试验、以及试验质量数据，应该在首页上特别标示出来。
所有的病理性（5类）和可能病理性（4类）变异都应报告。是否报告未分类变异（UVs-3类）则根据各实验室的实际情况而定，但实验室科学家和开单医生必须明确这些情况。
声明27：实验室自身的政策必须和国际指南保持一致，对于报告的基因变量，实验室应在对其提供分析之前就明确界定，并记录在案。
声明28：必须收集UVs的数据，目的是最终对这些变异进行明确的分类。
需要有一个团体来收集和共享已知的数据，目的是最终将这些变异归类为病理性（5类）或良性（1类）。
实验室或研究所对主动发现和次要发现所采取的策略必须能够反映在实验室的日常工作和报告中。
声明29：实验室应该在开始试验之前建立明确的步骤来阐述主动发现和次要发现。
鉴于这一领域中新的发现和进展，诊断性实验室不应由于分析“旧”数据而超负荷。实验室只提供在现阶段已知的和已验证的结果。
声明30：不应期待实验室去系统性重新分析旧的数据并报告新的发现，即使当核心疾病基因集合已经发生改变也不应如此。
从另一方面讲，在一个特定的时刻，应由这一疾病的实验室或团体的专家来将某一变异从某一级别更改至另一级别，实验室则应负责重新分析可靠的数据，在新的证据基础上重新发放报告，重新联系开单临床医生，因为病人很可能会受到该变异的新的状态的影响。在这种情况下，应该有一个体系来将病人和变异关联起来，当变异被重新分类之后检索受累病例。
声明31：为了能够管理好疾病变异，实验室应建立自己的针对不同疾病的变异数据库。
研究和诊断的区别
随着在全基因组检测用于诊断和研究的可能性逐渐增加，诊断和研究之间的分界就逐渐模糊起来，因此，阐述清楚对于诊断性资料，我们能做什么，应该做什么，需要签署哪一种类型的分析特异性研究知情同意书，都是非常重要的事情。这并不排除对诊断性结果做进一步研究的建议，但是，在任何情况下都应该明确区分诊断和研究。
声明32: 诊断性试验是指任何一种直接回答和病人的医疗情况相关的临床问题的试验。
声明33:研究性试验是指提出一个假说，其结果可能会和该计划中入组病人之间存在有限的临床相关性。
声明34:诊断性试验的结果，尤其是全外显子或全基因组分析的结果，可以是产生自某个假说。
在诊断过程中采用获自NGS的外显子或基因组数据是可以被接受的，如果其目的是为了获得一个遗传学诊断、且其分析仅限于那些已知和某种疾病相关的基因。
声明35: 如果诊断性试验的主要目的是给某一个病人做出诊断，那么该试验应该在认证实验室进行。
当病人及其家属参加某一个研究计划时，他们必须要明确这样的计划可能会获得和某种遗传性疾病相关的诊断或预测性的信息。在研究中，临床相关性的结果只能在获得诊断性试验确认之后才能发送至病人的医疗记录中。
声明36:在将研究性结果发送给病人之前必须在认证实验室确认该结果。
为了使对变异的解释更加容易，大多数实验室会给所有在自己实验室进行测序/分析的样本（理想的情况是有健康的父母）的变异频率建立数据库。这样的数据库不包括任何敏感信息，基于隐私规则的考虑也不权衡这些数据对提高诊断水平和改善健康保健的重要性。
声明37:所有在诊断性或研究性试验中获得的健康个体的变异频率都应被分享。
在理想的情况下，所有检测到的和疾病相关基因的变异都应该发送到病理性变异的数据库中，并且将其与病人的临床资料相关联，同时也要明确描述对变异分类的标准和争议。
声明38:所有报道的变异都应该发送至联邦、地区、国家、和/或国际数据库分享。
文献引自：Matthijs G, Souche E, Alders M, et al.Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. Euro J Hum Genet.2016;24:2-5
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