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如何分析电泳

2021.8.29
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空空

好好工作,天天开心

在凝胶电泳仪中,DNA或蛋白质样品的分离(通常基于大小)是通过施加电场使它们迁移通过凝胶来分离的。凝胶电泳在生物医学研究实验室中是常规操作,可用于回答各种不同的问题,因此,实际上并没有一种通用的方法来分析结果。
例如,诸如蛋白质印迹,RNA印迹和DNA印迹的不同技术都涉及凝胶电泳。
如果您要进行DNA样品的琼脂糖凝胶电泳(常见的一种方法),通常需要至少做两件事:1)区分未切割的质粒与插入片段,带切口的质粒和切割的质粒,以及2)估计使用标准曲线Excel或计算器计算各种DNA片段的大小。
运作方式如下。
检查您的实验室笔记本以确定哪些样品已装入哪些通道。当装载凝胶孔时,您应该注意每个泳道/样品的身份。
确定哪个泳道包含DNA标准的“阶梯”。这些是已知长度的片段。它们的迁移距离可用于通过标准曲线Excel或其他计算器确定样品片段的大小。
用尺子测量从孔到跟踪染料的图像距离,该染料比任何DNA条带都行进的距离远(换句话说,它将位于凝胶的底部)。记录此数字-您使用的单位并不重要。
测量照片上从孔到“阶梯”中每个带的距离,然后用该距离除以跟踪染料带所经过的距离。此计算为您提供每个频段的相对迁移率。
示例:假设跟踪染料带移动了6英寸,而我们有三个带移动了5、4.5和3.5英寸。
他们的相对流动性是什么?答:我们将5、4.5和3.5除以6得到的相对迁移率分别为0.833、0.75和0.5833。
将相对迁移率输入到电子表格程序(Excel或您使用的任何其他类似程序)中,并将阶梯中每个片段的大小(以千碱基为单位)一起输入。
制造商会为您提供他们提供的梯子中每个碎片的大小,因此您应该已经有了此信息。
在x上绘制具有相对移动性的数据,在y上绘制以千为单位的大小的数据。
在电子表格程序上使用趋势线函数将方程拟合到数据中。该方程式应为幂方程式(例如x ^ -2),并且应相对较好地拟合数据(R系数至少为0.9)。这将创建一条曲线和一个标准曲线Excel。
查看与您的样本相对应的谱带。
请记住,较小的DNA片段比较大的DNA片段穿过凝胶的距离更远,因此靠近跟踪染料的片段将小。但是请注意,如果未切割质粒(环状)DNA,它将像电话线一样“超螺旋”或扭曲,这实际上会使它比相同大小的线性DNA传播得更远。
同样,未完全切割的“切口”质粒将比相同大小的线性DNA传播更短的距离。因此,您无法从凝胶中估计未切割质粒的大小。
将每个泳道中的条带与您在该泳道中加载的样品的标识相匹配,并确定您所看到的是否是您所期望的。这将取决于实验的性质。
但是,一般来说,如果您用两种限制性酶消化插入质粒,则可以预期该插入物中将没有质粒。
由于它比质粒小得多,您可能会在该泳道中看到两条带,一条靠近顶部,而另一条靠近底部。仅用一种限制酶切割的质粒应仅形成一条条带,该条带比用两种限制酶切割的质粒行进的距离要远一些,但不能远至插入片段。

丁香通
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