(1)DNA 的粗提
①试剂
a.2倍 CTAB 提取缓冲液:100mmol/L Tris·Cl(pH8.0),20 mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2%CTAB,40mmol/Lβ-巯基乙醇。
b.10%CTAB:10%CTAB,0.7mol/L NaCl。
c.1倍 CTAB 沉淀缓冲液:50mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10mmol/L EDTA,1%CTAB,20mmol/Lβ-巯基乙醇。
②操作
a.取1~50g 新鲜植物材料,于液氮中研成粉。
b.将冻粉转入预冷的离心管中,立即加入等体积65℃预热的2倍 CTAB 提取缓冲液充分混匀,65℃保温10~20min,其间不时摇动。
c.加入等体积的氯仿/异戊醇,轻缓颠倒离心管混匀,室温下,12000r/min 离心10~20min。
d.将上清液转入另一离心管中,加入1/10体积的10%CTAB,混匀,加入等体积的氯仿/异戊醇,颠倒离心管混匀,室温、12000r/min离心10min。
e.取上相,重复d操作1次。
f.将上相转入新的经硅烷化处理的离心管中,加入1~1.5倍体积的1倍 CTAB 沉淀缓冲液,混匀,室温下放置30min,观察沉淀生成。如无明显沉淀生成,延长放置时间,随放置时间延长,沉淀量增加。
g.3500~4000r/min 离心5~10min,去上清液,沉淀吹干,备纯化用。
(2)DNA 粗提物的纯化
方法I
①试剂
a.1mol/L 乙酸铵。
b.7.5mol/L 乙酸铵。
②操作
a.按 0.5mL/g 材料的比例加入1mol/L 乙酸铵溶液,使沉淀溶解完全,再加入7.5mol/L 乙酸铵至终浓度为2.5mol/L。
b.加入2倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。
c.用细玻璃棒缠出 DNA 纤维,或10000min 离心5min,弃去上清液。
d.用70%乙醇漂洗沉淀,吹干,沉淀溶于适量TE。
e.加入1μL 1mg/mL RNase,于4℃放置,备用。
方法Ⅱ
①试剂
a.CsCl 梯度溶液:取 TE 缓冲液(pH8.0)25mL,加入CsCl 25g,溶解后按 5mg/mL 比例加入 EB。
b.异丙醇溶液:向任意量的异丙醇中加TE缓冲液至两相出现,搅拌状态下缓慢加入固体CsCl 至下相(TE 相)中出现白色沉淀,将两相混匀。
②操作
a.向粗提的 DNA 沉淀加入适量 CsCl 梯度溶液,置50℃水浴中轻搅溶解。
b.将溶解好的梯度液转入超速离心管中严格平衡,封管,20℃、50000离心力离心过夜。
c.取出离心管,置紫外灯下观察 DNA 条带,穿刺取出,转至另一离心管中。
d.加入等体积的异丙醇溶液,轻缓混匀,静置至分层,去上层。
e.重复 d 抽提数次,至紫红色消失。
f.去除 EB 的下相中加入2倍体积的 TE 缓冲液稀释,混匀,加入2倍体积的异丙醇,混匀,室温下放置10min。
g.12000离心力离心10min,沉淀溶于适量TE缓冲液中。