质粒DNA的提取、纯化和电泳检测
摘要
本实验通过碱变性法提取E.coli DH5α(pUC19)的质粒DNA,并且通过一系列的分离纯化技术将其质粒DNA与染色体DNA、RNA、蛋白质等杂质分开从而得到纯化的质粒DNA分子。通过琼脂糖凝胶电泳可以通过DNA条带的位置来大致判断其分子大小,也可以将实际电泳的结果和理论结果相对比,分析差异产生原因,从而完善实验方法,严谨实验步骤。
关键词碱变性法分离纯化技术琼脂糖凝胶电泳
引言
质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外,另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(DNA)。质粒在基因工程中是一类重要的载体,其作用主要是携带一些基因片段(可以是编码基因,也可以是调控区等),在细胞内环境中进行表达或参与通路的相互作用,通过将质粒转化到宿主细胞可以探究基因相互作用关系,取得蛋白产物,实现特定基因片段的克隆等。总之,质粒在生物科学研究方面具有广泛的作用。
提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-***化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用。碱裂解/碱变性法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的分离方法。在pH12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA恢复原来的构型,保存在溶液中;染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,通过离心被除去。最后,质粒DNA用冰乙醇沉淀获得。由于DNA和RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/***仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质,具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动
速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
正文
1.材料和方法
1.1材料和试剂
实验材料:E.coli DH5α(pUC19)。
实验试剂:LB液体培养基、氨苄青霉素(Amp)母液(储存浓度100mg/mL)、溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mM EDTA (pH 8.0);溶液Ⅱ:0.2MNaOH,1% SDS;溶液Ⅲ:5MKAc(pH 4.8);TE溶液:10mM Tris-HCl,1mM EDTA (pH 8.0);冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris饱和酚、***仿/异戊醇混合液、酚/***仿/异戊醇(PCI)(25:24:1)混合液、3M NaAc溶液、灭菌双蒸水ddH2O、50×TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭(EB)溶液、6×上样缓冲液(6×loading buffer)。
1.2实验方法
大肠杆菌的增值
用牙签从LB固体培养基挑取E.coli DH5α(pUC19)菌落于LB+Amp(Amp工作浓度为100μg/mL)液体培养基中,置于37℃、200rpm培养箱下振荡过夜培养。
实验前准备
(1)用搪瓷杯取一杯冰。
(2)将小烧杯放在天平上,调至平衡。
(3)配置80ml溶液Ⅱ: 将原液10M NaOH,10% SDS配制成0.2M NaOH,1% SDS。取用8ml SDS,1.6ml NaOH和70.4ml蒸馏水配置。
3. E.coil菌株的收获( 4°C操作)
(1)取一个灭菌离心管,称重,标记为W1 14.552g
(2)倒入菌液至距瓶口1/3处,两两配平
(3) 6000rpm,离心5min,弃上清
(4)加入5ml 溶液Ⅰ,涡旋, 6000rpm,5min,弃上清,称重为W2 14.676g,计算W2-W1 0.124g。
4.细胞裂解提取质粒DNA ( 4°C操作)
向菌体沉淀中量加入(按菌体量接近的重新分组,溶液Ⅰ补平)
(1)2.0 mL 溶液Ⅰ,充分涡旋振荡;用溶液Ⅰ再次配平
(2)4.0 mL溶液Ⅱ,轻柔颠倒混匀,冰浴3-5mi
(3)3.0 mL 溶液Ⅲ,轻柔颠倒混匀,冰浴5mi
(4)12000rpm, 15min;小心转移上清到新的离心管内,记录体积V。
(5)加入2V冰乙醇,颠倒混匀;-20℃,15min;。
(6)12000rpm,15min,弃上清。
(7)加入5mL70%乙醇,12000rpm,3min,吸弃上清。
(8)重复乙醇洗涤一次;37℃风干5-10min。
(9)分次加入0.5mL TE溶液两次,将沉淀吹开吹匀,并移到Ep管中,得质粒DNA粗提物
(10)加入5μl RNase A(10mg/ml),终浓度为50μg/mL,37℃孵育1-2小时。
5.质粒DNA的纯化
将1mL质粒DNA粗提物分出500μL到一新EP管中,使得每组两管。每个EP管进行如下操作:
(1)加入等体积的Tris饱和酚,涡旋振荡,12000rpm,5mi
(2)转移上清V1(两管均为400μL)至新管,加入V1的酚/***仿/异戊醇混合液,涡旋振荡(<1min),12000rpm,5mi
(3)转移上清V2(一管为400μL,一管为378μL)至新管,加入V2的***仿/异戊醇混合液,涡旋振荡(<1min),12000rpm,5mi
(4)转移上清V3(两管均为250μL)至新管,加入1/10 V3的3M NaAc溶液(pH=5.2),再加入2V4(V4=V3+1/10V3)的冰乙醇,震荡混匀,-20℃保存30mi
(5)12000rpm,15min,弃上清
(6)加入500μL 70%乙醇洗涤,12000rpm离心2min,弃上清
(7)重复洗涤一次,吸弃上清,37℃风干5mi
(8)每管加入25μL TE溶解沉淀,合并,得50μL纯化质粒DNA。
6. 1% 琼脂糖凝胶的制备
(1)配制2L 1×TAE:取40mL 50×TAE,用双蒸水将其稀释至2L
(2)正确组装制胶槽、制胶板、样品梳
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文档介绍：
(3)取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中,称量0.4g琼脂糖,混匀,轻旋瓶盖,微波炉加热沸腾3-4次,至溶液澄清无颗粒
(4)待溶液冷却至60℃左右,加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭(EB)溶液,使EB溶液终浓度为0.5mg/L,混匀后倒入制胶槽中,冷却凝固待用(冷却凝固时间要在30min以上)。
7.电泳上样
(1)取2.0μL纯化DNA、2μL双蒸水、1μL上样缓冲液(6×loading buffer),用微量移液器吹吸混匀
(2)将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中,添加1×TAE至高出胶面约1mm
(3)将上述混合好的DNA样品,按照下表顺序,点样到凝胶中。。
8.凝胶电泳与DNA分离
(1)开启电泳仪电源,选择合适的电压120V和时间40mi
(3)将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极,与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极,与电泳仪负极相连
(4)启动电泳,待观察到负极有气泡升起方可离开
(5)电泳结束,关闭电源,取出凝胶,在紫外灯下观察电泳条带。
2.实验结果
表 DNA样品加样顺序
泳道
DNA
样品/
marker
超螺旋marker
UC19
UC19/HindⅢ
1组DNA样品
2组DNA样品
3组DNA样品
4组DNA样品
5组DNA样品
超螺旋marker
样量
6μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
6μL
泳道
10
11
12
13
14
15
16
17
DNA
样品/
marker
6组DNA样品
6组DNA样品(阳性对照)
7组DNA样品
8组DNA样品
9组DNA样品
10组DNA样品
UC19
HindⅢ
UC19/
样量
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5,026
5,026
3,049
2,087
图碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳
泳道1与泳道9 加的样品是Supercoiled DNA Ladder Marker。supercoiled DNA Ladder Marker 由8种超螺旋的质粒DNA 构成,DNA大小分别为:2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中5,026 bp的条带最亮。
泳道2与泳道17加的样品是pUC19质粒。DNA,即超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA,其条带在2.7kb左右,起对照作用。
泳道3与泳道16加的样品是用HindⅢ酶切的pUC19质粒。HindⅢ酶切pUC19的结果是使超螺旋的共价闭合环状结构的pUC19质粒DNA的链断裂成线状的DNA, 线状DNA电泳速率减慢。但是实验中所用的HindⅢ没有将pUC19酶切充分,因此泳道3与泳道16电泳后会形成两条条带,其中暗带是被HindⅢ酶切的pUC19 质粒,明带是没有被HindⅢ酶切的pUC19质粒。
泳道11是没有加RNase的对照组的电泳图像,由于RNA易形成各种高级结构,同样大小的DNA和RNA相比,RNA的电泳速率快。泳道11下方的大量明带即为RNA电泳区域。
除了泳道15存在pUC19质粒所在区域条带,其他组的都无或无明显的pUC19质粒所在区域的条带,包括泳道15在内的所有组的条带位置都偏低,因为碱变性法有缺陷:容易导致不可逆的变性,不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长,这种变性就是不可逆的了,我们碱变性时间太长,导致质粒DNA的变性不可逆,所以实际条带位置和预估不一样。
除了位置偏下的质粒DNA带以外,每一组都存在中间位置较弱的杂带(实心箭头所指),我们推测此杂带是没有被沉淀的,在加了有机物后涡旋震荡过程中所产生的线性染色体DNA的碎片,DNA,所以它的位置偏后。这一杂带在泳道4、7、8、10、12和16尤为明显。
个别组在加样孔下方也存在较窄的DNA条带(线性箭头所指),据推测,这种条带的产生是质粒DNA沉淀中少量染色体DNA杂质的存在而产生的,由于染色体DNA片段过大,1%的琼脂糖凝胶的分辨率有限,片段过大的DNA在电泳时速度极慢或很难穿过琼脂糖凝胶的孔径,因此,形成离上样孔近的较窄的杂带。这一杂带在泳道4、7、10和12尤为明显。
个别组在加样孔处也存在较弱的DNA条带(方形箭头末端所指),我们推测可能是没有除尽的蛋白质把加样孔堵住了,导致少数DNA无法从加样孔跑到凝胶当中去。这一杂带在泳道4、7、10和12尤为明显。
我们组的质粒DNA(0.124g)在泳道13,和其他泳道相比,我们的质粒DNA的条带稍微偏弱,这说明我们在组提取质粒DNA时有一定的DNA损失,但是我们组的DNA碎片和染色体DNA杂带也相对较弱,这可能和我们所提取的DNA量较少有关(和泳道4对照,由于此组提取的质粒DNA量较大,所获得的杂带也较明显。因此,不能因为我们组的杂带少而确定我们组的结果好),也有可能是我们的杂质除去得较为充分(和泳道14相比,我们组的杂带明亮程度和他们相近,但是我们的目标带明显比他们亮度高)。
3.讨论
加入5ml 溶液Ⅰ,涡旋的目的是重悬并洗涤菌体。溶液Ⅰ中葡萄糖的作用是为细胞提供等渗环境,
Tris-HCl作为pH缓冲液,为细胞提供适宜酸碱环境,EDTA(pH 8.0时溶于水)是重要金属螯合剂,可以与Mg2+、Ca2+等金属络合,抑制DNase对DNA的降解作用。离心后尽可能去除干净上清液,减少培养基对实验结果的影响。
加入2.0 mL 溶液Ⅰ的作用是重悬并洗涤菌体。
加入4.0 mL溶液Ⅱ的目的:①SDS能断裂分子内和分子间氢键,使分子去折叠,从而破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构而达到裂解细胞的目的。加入溶液Ⅰ后,溶液变得清亮粘稠,变得清亮是由于细胞破碎了,粘稠是由于细胞内蛋白质等有机物析出。加入溶液Ⅰ要慢慢颠倒,使之混匀,不能烈震荡。震荡过于剧烈会使染色体DNA断裂成碎片,导致在质粒DNA中引入杂质。②NaOH的碱裂解作用和碱变性作用:NaOH可以与蛋白质结合(细胞膜含有蛋白质)从而破碎细胞;在pH12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,而质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。因此可通过之后对pH值的调节达到分离染色体DNA与质粒DNA的目的。
此步骤等待时间不能过长,因为强碱也会破坏质粒DNA。
加入3.0 mL 溶液Ⅲ(5M KAc(pH 4.8))的作用是使质粒DNA复性,而染色体DNA太长难以复性从而沉淀出来。不能复性的染色体DNA与
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