1蛋白质的处理:由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附,并可使溶胶聚沉,故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意,蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒,否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在,因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
2蛋白质最适用量的选择:将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后,分别取0.1mL(含蛋白质5～40μg)加到1mL胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质的对照管,5min后加入0.1mL10%NaCl溶液,混匀后静置2h,不稳定的金溶胶将发生聚沉,能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。
见标记步骤:在接近并略高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
1）用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
2）于100mL金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2～3mL),搅拌2～3min。
3）加入5mL1%PEG20000溶液。于10000～100000g离心30～60min,小心吸去上清液。
4）将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mLPEG20000的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以Alcm/540nm=1.5左右为宜,以0.5mg/mL叠氮钠防腐,置4保存。
5）包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG-200柱进行凝胶层析分离纯化,以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2,以A蛋白包被的金溶胶洗胶液pH为7.0。
以上操作中应注意,一切溶液中不应含杂质微粒,可用高速离心或微孔滤膜预处理。
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