免疫亲和柱荧光计快速测定玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮快速分析技术

1、简述

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),又称 F₂ 毒素,是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌、串珠镰刀菌、木贼镰刀菌、燕麦镰刀菌、雪腐镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物,是一种雌激素真菌毒素。化学名为6-(10-羟基-6-氧基-1-炭烯基)β-雷琐酸-μ-内脂,是一种白色的结晶,分子式为 C₁₈H₂₂O₅,相对分子质量为318;熔点为164～165℃;紫外线光谱最大吸收为236nm,274nm 和316nm;红外线光谱最大吸收为970nm。纯的玉米赤霉烯酮不溶于水、二硫化碳和四氯化碳,溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、醋酸乙酯、乙腈和乙醇,微溶于石油醚(b.p.30～60℃),在紫外线照射下呈蓝绿色。

玉米赤霉烯酮首先从赤霉病玉米中分离,有15种以上的衍生物,其主要存在于玉米和玉米制品中,小麦、大麦、高粱、大米中也有一定程度的分布,ZEN 主要污染玉米、麦类、谷物等。

玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用,可引起动物发生雌激素亢进症,导致动物不孕或流产,对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大,给畜牧业带来经济损失。饲料中1mg/kg 的玉米赤霉烯酮就会使动物产生雌性化,更高的浓度(50～100mg/kg)将会对怀孕、排卵、移植、胎儿的发育、新生动物儿的生存力产生不利的影响。

目前玉米赤霉烯酮的测定方法有免疫亲和柱荧光计法、薄层色谱法、气相色谱法、高压液相色谱法等。下面介绍的是免疫亲和柱荧光计快速测定法。

2、免疫亲和柱荧光计快速测定法

①试剂与设备

(1)4-系列真菌毒素专用荧光计。

(2)均质器(250mL)。

(3)微量移液器(1.0mL)。

(4)涡流混合器。

(5)玻璃纤微滤纸(1.0m)。

(6)VICAM 玉米赤霉烯酮亲和柱。

(7)聚乙二醇(PEG),相对分子质量8000。

(8)色谱级甲醇。

(9)色谱级乙腈。

(10)氯化钠。

(11)VICAM 玉米赤霉烯酮衍生液。

(12)VICAM 真菌毒素通用标定标准物。

(13)0.1%吐温-20/PBS 缓冲液。

②标定值的设置:使用 VICAM 真菌毒素通用标定标准物

③试验准备

(1)标定荧光计。

(2)确认延时时间为300s。

(3)配制1倍0.1%吐温-20/PBS缓冲液(每月配制一次,或根据需要配制)。

(4)配制提取液:乙腈/水(90:10,体积比),或者甲醇/水(80:20,体积比)。

(5)试剂空白试验(1mL 甲醇+1mL 显色剂置于测试管中),荧光计读数应为0。

(6)空白试验(2mL 纯水置于测试管中),荧光计读数应为0。

④样品提取

(1)称取20g 磨细的样品,2g 氯化钠,置于搅拌杯中。

(2)加入50mL 甲醇/水(80+20)溶液,或者乙腈/水(90+10)。

(3)盖上搅拌杯的盖子,高速搅拌2min。

(4)取下盖子,将提取物倒入折叠式滤纸上,滤液收集于干净的容器中。

⑤提取物的稀释

(1)移取10mL 上步的滤液,置于干净的容器中。

(2)用40mL 1倍0.1%吐温-20/PBS 缓冲液稀释,混匀。

(3)将上步稀释液通过玻璃微纤维滤纸(1.0μm)过滤,滤液收集于玻璃注射器筒中量取10mL。

⑥分离柱色谱操作与测定

(1)将上步10mL 滤液(10mL 相当于0.8的样品),以1～2滴/s 的流速全部通过 Zearala Test 亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。

(2)将10mL 0.1%吐温-20/PBS 缓冲液以1～2滴/s的流速通过亲和柱。

(3)将10mL 纯水以2滴/s的流速通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。

(4)用1.00mL HPLC 级的甲醇以1滴/s的流速淋洗亲和柱,将所有样品淋洗液(1mL)收集于玻璃测试管中。

(5)将1.00mL ZearalaTest 显色剂加到测试管的淋洗液中。混匀后,将测试管置于已标定好了的荧光计中。300s 后,读数。

(6)检测限:0.10mg/kg,测定范围0～5.0mg/kg。