酶联免疫吸附测定法测定T-2毒素

测定小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附法有间接竞争性酶联免疫吸附测定法和直接竞争性酶联免疫吸附测定法。

(1)间接法

①试剂

a.化学试剂:T-2毒素,四甲基联苯胺,甲醇,石油醚,三氯甲烷,无水乙醇,乙酸乙酯,二甲基甲酰胺,吐温-20,30%过氧化氢等。

b.缓冲溶液

包被缓冲液:50mmol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液,PH9.6。

洗液:含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液,PH7.4。

样品与T-2毒素标准溶液稀释液,含20%甲醇的溶液。

底物缓冲液:0.1mol/L的磷酸-柠檬酸缓冲液,PH5.0。

底物溶液:取50μL 四甲基联苯胺溶液加10mL 底物缓冲液、10μL 30%过氧化氢混匀。

终止液:1mol/L 硫酸溶液。

c.T-2毒素标准溶液:用甲醇配成1mg/mL T-2毒素贮备液,20℃冰箱贮存。于检测当天,精密吸取贮备液,用稀释液稀释成制备标准曲线的所需浓度。

d.包被抗原:T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物。

e.抗体:抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。

f.酶标二抗:兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物。

②测定方法

a.提取与净化  称取20g 粉碎并通过20目筛的样品,置200mL 具塞锥形瓶中,加8mL 水和100mL 三氯甲烷-无水乙醇(4:1),密塞,振荡1h,通过滤纸过滤,取25mL 滤液于蒸发皿中,置90℃水浴上通风挥干用50mL 石油醚分次溶解蒸发皿中残渣,洗入250mL 分液漏斗中,再用20mL甲醇水(4:1)分次洗涤,转入同一分液漏斗中,振摇1.5min,静置约15min,取下层甲醇水提取液过层析柱净化(层析柱的装备:在层析柱下端与小管相连接处塞约0.1g 脱脂棉,尽量塞紧,先装入0.5g 中性氧化铝,敲平表面,再加入0.4g 活性炭,敲紧)。

将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中,并于水浴锅上浓缩至干,趁热加3mL 乙酸乙酯,加热至沸,挥干,再重复一次,最后加3mL 乙酸乙酯,冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿,并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅上,挥干冷却后,用0.5mL 的稀释液定容。

b.酶联免疫吸附测定方法具体步骤  用包被抗原(4μg/mL)包被酶标板,每孔100L,4℃过夜;酶标板用洗液洗3次,每次3min后,加入不同浓度的T-2标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品中的毒素含量)与抗体溶液(1:50000)的混合液(1:1,每孔100μL,该混合液应于使用的前一天配好,4℃过夜备用),置37℃,1h;酶标板洗3次,每次3min 后,加入酶标二抗每孔100μL,置37℃,1.5h;同上述洗涤后,加入底物溶液,每孔100μL,置37℃,30min;用终止液终止反应,每孔50μL,于450nm 处测定 OD 值。

c.结果判定与计算  样品检测孔所测得的OD值大于(或等于)阳性对照孔 OD 值,该样品为阴性;反之,则为阳性。阳性样品的毒素含量可根据下式计算。

T-2毒素含量

式中C——酶标板上所测得的T-2毒素的量,ng,根据标准曲线求得;

V₁——样品提取液的体积,mL;

V₂——滴加样液的体积,mL;

D——样液的总稀释倍数;

m——样品质量,g

(2)直接法

①试剂

a.化学药品:同间接法。

b.缓冲液系统:用间接法。

c.T-2毒素标准溶液:同间接法。

d.包被抗原:同间接法。

e.抗体:抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。

②测定方法

a.提取与净化同间接法。

b.测定步骤用包被抗原(4μg/mL)包被酶标板,每孔100μL,4℃过夜;酶标板用洗液洗3次,每次3min 后,加入不同浓度的 T-2毒素标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品毒素含量)与抗体辣根过氧化酶结合物溶液(1:100的混合液(1:1,每孔100μL,该混合液应于使用的前一天配好,4℃过夜备用),置37℃,1.5h酶标板洗3次,每次3min 后,加入底物溶液。每孔100μL,置37℃,30min。用终止液终止反应,每孔50μL,于450nm 处测定 OD 值。

c.测定结果与计算同间接法。