由于大部分蛋白质都能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液,所以蛋白质的提取一般是以水溶液为主,其中盐溶液和缓冲溶液对蛋白质的稳定性好、溶解度大,是提取蛋白质最常用的溶剂。当细胞粉碎后,用盐溶液或缓冲溶液提取蛋白质时,应注意以下一些条件。
(1)盐浓度
常用等渗盐溶液,尤其以0.02～0.05mol/L磷酸缓冲溶液和碳酸缓冲落液、0.15mol/L氯化钠溶液应用较多。但有些蛋白质在低盐浓度下溶解度较低,需用浓度较高的盐溶液,如脱氧核糖核蛋白需用1mol/L以上的氯化钠溶液提取;而另一些蛋白质则在低盐浓度溶液或水中溶解度较高,如某些霉菌中的脂肪酶用水提取效果更好。因此,在用水溶液提取蛋白质时,需根据所要提取的蛋白质来选择不同种类和不同浓度的盐溶液。
(2)pH值
由于蛋白质的溶解度和稳定性与pH值关系很大,因此pH值的选择对蛋白质的提取十分重要。提取蛋白质时,提取溶液的pH值应选定在该蛋白质的稳定范围,在该蛋白质等电点的两侧,提取碱性蛋白质时要选在偏酸一侧,提取酸性蛋白质时要选在偏碱一侧,以增大蛋白质的溶解度,提高提取的效率。
3.RNA的提取
用0.14mol/L氯化钠溶液将组织作匀浆并反复提取细胞质中的核蛋白,而留下含有DNA的细胞核物质,然后用10%乙酸调至pH4.2沉淀,离心弃去上清液,先用0.5mol/L氯化钠溶液沉淀后用水洗涤沉淀,得核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氢钠溶液中,离心,取上清液,调至pH4.2沉淀,以0.5mol/L氯化钠溶液再一次除脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白质可用含少量辛醇的氯仿抽提除去,核酸留在碳酸氢钠溶液中,加入乙醇,RNA以钠盐形式沉淀出来。
破碎细胞做成匀浆时,加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠,加入含水苯酚,与匀浆一起振荡,DNA与蛋白质沉淀于苯酚层,水层中含有RNA和多糖,然后用乙醇使RNA沉淀。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法。
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