(1)加热法
当待测组分热稳定性好时,可采用加热的方法将一些热变性蛋白质沉淀。加热温度视待测组分的热稳定性而定,通常可加热到90℃。蛋白质沉淀后可用离心或过滤除去,这种方法最简单,但只能除去热变性蛋白质。
(2)盐析法
利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。在低盐浓度下,蛋白质溶解度随着盐浓度的升高而增加,称为盐溶作用。当盐浓度不断升高时,不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降,并先后析出沉淀,称为盐析作用。这是由蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团的静电引力造成的。由于水中加入了少量的盐,增加了溶液的极性,减弱了蛋白质分子间的作用力,促使其溶解度增大。当盐浓度增加到一定程度时,水活度被降低,蛋白质表面的电荷大量被中和,水化膜被破坏,白质分子又相互聚集沉淀析出盐析法的优点是对设备和条件要求低,安全,应用范围广泛,一般可在室温下操作常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。硫酸铵的盐析能力强,饱和液浓度大,溶解度受温度影响小,一般不会使蛋白质变性。缺点是缓冲能力差,pH值常在4.5～5.5。
盐析时要注意以下几个问题。
①盐的饱和度影响 盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素,不同的蛋白质盐析所要求的饱和度不同。
②pH值的选择 蛋白质在等电点(pI)时的溶解度最小,最易从溶液中沉淀析出,因此进行盐析时的pH值要选择在被沉淀蛋白质的pI附近。
③蛋白质浓度的影响 在相同盐析条件下蛋白质浓度越大,越易沉淀。
④温度的影响 一般可在室温下进行。
(3)等电点沉淀法
利用蛋白质在等电点时溶解度最低,用酸、碱调节pH值,可使蛋白质沉淀析出,但这时沉淀不完全,可与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。
(4)膜分离法
膜分离技术包括超滤、反渗析、电渗析、微孔过滤等。利用膜分离技术可将样品小分子化合物和大分子的蛋白质很好地分离。
超滤是一种除去样品中蛋白质和其他大分子的方法,是能用分子分离的薄膜分离技术,依靠薄膜两侧压力差作为推动力来分离溶液中不同分子量的物质。与沉淀法相比,其优点是适用于小量样品,不用稀释样品也不用改变样品的pH值,尤其适用于对酸、碱不稳定的化合物,特别是待测组分易被某种酶分解时,用超滤可除去该酶,避免欲测物分解。但超滤可能会由于待测组分结合在膜上而影响回收率。
超滤膜的制作材料有醋酸纤维素、聚酰胺、聚砜等,其中醋酸纤维素滤膜最常用。
(5)凝胶色谱法
利用分子大小不同的物质在流过凝胶固定相时的保留时间不同,大分子首先流出,小分子最后流出,可将待测小分子化合物与大分子蛋白质分离。这时待测小分子化合物的浓度被流动相所稀释,必要时还要进行浓缩后再用色谱分析。
(6)柱色谱法
用能吸附蛋白质的材料装填成小柱,使欲除蛋白质的样品流过小柱,样品中的蛋白质被柱填料吸附,欲测组分不被吸附,从小柱中流出。现已有厂家将这种小柱做成商品出售,称为预柱。这种预柱可以直接连在HPLC的进样装置上,含蛋白质的样品通过预柱后可直接进入HPLC系统分析。如分析尿中的某些代谢产物时,可将样品通过预柱,除去蛋白质,直接进入HPLC分析。这种预柱有各种规格,适用于各种不同的目的。
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